การวินิจฉัยวัณโรคในห้องปฏิบัติการ

วัณโรคเป็นโรคที่ง่ายต่อการวินิจฉัยในสภาพสมัยใหม่และความสำเร็จทางวิทยาศาสตร์ การวินิจฉัยโรควัณโรคในห้องปฏิบัติการเป็นหัวใจสำคัญของวิธีการวินิจฉัยอื่น ๆ รองจากการวิจัยด้วยวิธี X-ray

[1], [2], [3], [4],

การตรวจเลือดทางคลินิก

ในผู้ป่วยที่เป็นวัณโรคการเปลี่ยนแปลงในการวิเคราะห์ทั่วไปของเลือดไม่เป็นไปในทางพยาธิวิทยา ด้วยรูปแบบที่ จำกัด และไม่ได้ใช้งานของวัณโรค hypochromia ลักษณะของเม็ดเลือดแดงในปริมาณปกติของพวกเขา เมื่อแทรกตัวเข้าไปใหญ่หรือปอดบวม caseous ในขณะที่ความชุกของต่อมน้ำเหลือง caseous, แผลในลำไส้ที่เฉพาะเจาะจงเช่นเดียวกับปอดขนาดใหญ่หรือมีเลือดออกหลังการผ่าตัดและทราบอาการ erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu Macrocytosis poikilocytosis และยิ่งหายากมากมักจะมีโรคโลหิตจางรุนแรง จำนวน reticulocytes ในขั้นตอนการชดเชยวัณโรคช่วง 0.1-0.6% โดยมี subcompensated - 0.6-1.0% และ 1% เป็นลักษณะ reticulocytes decompensated

เมื่อผู้ป่วยวัณโรคในบางกรณีอาจจะมี leucocytosis ปานกลาง (ไม่เกิน 15,000 เม็ดเลือดขาว.), การฉายรังสีน้อยกว่าที่เกิดขึ้นใน 2-7% ของผู้ป่วยที่มี จำกัด และง่ายต่อกระบวนการที่เกิดขึ้นในรูปแบบและ 12.5% - โดยการทำลายล้างและความก้าวหน้าวัณโรคปอด .

การเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นบ่อยที่สุดเกิดขึ้นในสูตรเม็ดโลหิตขาว ทำเครื่องหมายทั้ง neutrophilia แบบสัมพัทธ์และแบบสัมบูรณ์การเปลี่ยนสูตร leukocyte ในระดับปานกลางไปทางซ้ายก่อน promyelocytes เซลล์เม็ดเลือดขาวมีน้อยมากในกรณีของวัณโรคที่ไม่ซับซ้อน การเพิ่มจำนวน neutrophils ที่มีรายละเอียดทางพยาธิวิทยาใน hemogram ของผู้ป่วยที่เป็นวัณโรคมักบ่งชี้ถึงระยะเวลาของกระบวนการ: ในผู้ป่วยที่มีวัณโรครุนแรง neutrophils เกือบทั้งหมดมี granularity ทางพยาธิวิทยา เมื่อการระบาดของโรควัณโรคสิ้นสุดลงการเปลี่ยนแปลงนิวเคลียร์จะเข้าสู่ภาวะปกติอย่างรวดเร็ว ความละเอียดทางพยาธิวิทยาของนิวโทรฟิลยังคงอยู่นานกว่าการเปลี่ยนแปลงอื่น ๆ ของ hemogram

เนื้อหาของ eosinophils ในเลือดส่วนปลายยังขึ้นอยู่กับระยะของกระบวนการและสภาวะภูมิแพ้ของสิ่งมีชีวิต จำนวนของพวกเขาลดลงจนถึง aneozinofiliya ในการระบาดอย่างรุนแรงและเป็นเวลานานของการเกิดโรคและตรงกันข้ามเพิ่มขึ้นในขณะที่แทรกตัวเข้าไปสลายและปอดไหลเช่นเดียวกับรูปแบบในช่วงต้นของวัณโรคหลัก

วัณโรคปฐมภูมิส่วนใหญ่จะมาพร้อมกับ lymphopenia ซึ่งบางครั้งสังเกตเห็นเป็นเวลาหลายปีแม้ว่าจะมีการเปลี่ยนแปลงเฉพาะบางครั้งก็ตาม วัณโรคทุติยภูมิในระยะของการกำเริบขึ้นอยู่กับความรุนแรงของกระบวนการอาจมาพร้อมกับตัวเลขปกติของ lymphocytes หรือ lymphopenia

มันเป็นสถานที่พิเศษการกำหนดอัตราการตกตะกอนของเม็ดเลือดแดงทดสอบเพิ่มเติมเพื่อประเมินกระบวนการวัณโรค (ESR) มีค่าในการประเมินกระบวนการไหลวัณโรคและระบุรูปแบบการใช้งานของมัน เพิ่มขึ้น ESR บ่งชี้ว่าการปรากฏตัวของกระบวนการทางพยาธิวิทยา (ติดเชื้อการอักเสบ, การติดเชื้อหนอง, hemoblastosis, Hodgkin et al.) และบ่งบอกถึงความรุนแรงของมัน แต่ระดับปกติไม่เคย ESR บ่งบอกถึงตัวตนของพยาธิวิทยา เร่งการตกตะกอนของเม็ดเลือดแดงนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของระดับเลือดของโกลบูลิ, fibrinogen คอเลสเตอรอลและลดความหนืดของเลือด การชะลอตัวของการตกตะกอนของเม็ดเลือดแดงเป็นลักษณะของรัฐที่มาพร้อมกับการหดตัวการเพิ่มขึ้นของปริมาณอัลบูมิและกรดน้ำดี

Hemogram ในผู้ป่วยวัณโรคจะเปลี่ยนแปลงไปในระหว่างการรักษา การเปลี่ยนแปลงทางโลหิตวิทยาจะหายไปเร็วขึ้นการแทรกแซงการรักษาที่ประสบความสำเร็จยิ่งขึ้น อย่างไรก็ตามควรคำนึงถึงผลกระทบต่อการใช้ยาต้านเชื้อแบคทีเรียหลายชนิด พวกเขามักจะทำให้เกิด eosinophilia ในบางกรณี - leukocytosis และ leukopenia บ่อยขึ้นถึง agranulocytosis และ lymphoid - reticular ปฏิกิริยา การควบคุมทางโลหิตวิทยาอย่างเป็นระบบและการวิเคราะห์ข้อมูลที่ถูกต้องมีความจำเป็นสำหรับการประเมินสถานะทางคลินิกของผู้ป่วยพลวัตของกระบวนการและประสิทธิภาพของการรักษาที่ใช้

[5], [6], [7], [8], [9],

การวิเคราะห์ทางคลินิกของปัสสาวะ

ด้วยการเป็นวัณโรคของระบบทางเดินปัสสาวะการวิเคราะห์ปัสสาวะเป็นวิธีการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการหลัก คุณสามารถสังเกตการเกิด leukocyturia, เม็ดเลือดแดง, โปรตีนชัก, hypoisostenuria, tuberculosis mycobacterium, bacteriuria ที่ไม่เฉพาะเจาะจง

Leukocyturia เป็นอาการที่พบได้บ่อยที่สุดในวัณโรคของระบบทางเดินปัสสาวะก่อนที่จะมีการบำบัดด้วยเคมีบำบัดเฉพาะและจะหายไปเฉพาะในกรณีพิเศษเช่นมีการทำลาย obliteral ureteral อย่างสมบูรณ์ ทดสอบ Nechyporenko (กำหนดจำนวนของเม็ดเลือดขาวใน 1 มิลลิลิตรของปัสสาวะ) จะช่วยให้การเพิ่มเติมอคติประเมิน nefrotuberkuloze ศึกษาระดับปริญญา leukocyturia ด้วยและในบางกรณีที่จะระบุไว้ที่ปัสสาวะปกติ อย่างไรก็ตามควรคำนึงถึงว่า leukocyturia อาจเกิดขึ้นได้ในโรคไตอักเสบกระเพาะปัสสาวะอักเสบไตและก้อนไต

Eritrotsiturii เช่นเดียวกับ leukocyturia ถือได้ว่าเป็นหนึ่งในอาการที่พบได้บ่อยที่สุดในวัณโรคของระบบทางเดินปัสสาวะ ความถี่ของการเกิด hematuria ขึ้นอยู่กับความชุกของกระบวนการนี้จะเพิ่มขึ้นเมื่อกระบวนการวัณโรคที่ทำลายล้างได้พัฒนาขึ้นในไต Erythrocyturia ที่ไม่มี leukocyturia เป็นแบบปกติสำหรับระยะเริ่มแรกของวัณโรคไต Hematuria ซึ่งมีอิทธิพลเหนือ leukocyturia เป็นอาร์กิวเมนต์ที่สำคัญในการสนับสนุนวัณโรคไตในความแตกต่างของมันด้วย pyelonephritis ไม่เฉพาะเจาะจง

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

การตรวจเลือดทางชีวเคมี

วัณโรคมีการเปลี่ยนแปลงในตัวแปรทางชีวเคมีบางส่วนขึ้นอยู่กับขั้นตอนของกระบวนการภาวะแทรกซ้อนและโรคต่างๆที่เกิดขึ้นพร้อมกัน ในผู้ป่วยวัณโรคที่ไม่ได้ใช้งานของปอดและอวัยวะอื่น ๆ โปรตีนและโปรตีนในซีรัมจะไม่เปลี่ยนไปและกำหนดเนื้อหาปกติ

ในรูปแบบเฉียบพลันของโรคเช่นเดียวกับการกำเริบและความก้าวหน้าของรูปแบบเรื้อรังของวัณโรคค่าสัมประสิทธิ์ของ albumin-globulin ลดลง

ที่จำเป็นในการประเมินสถานะการทำงานของความเสียหายอินทรีย์และตับในผู้ป่วยวัณโรคและภาวะแทรกซ้อนของมันคือความมุ่งมั่นของยอดรวมในซีรั่มและบิลิรูบินตรง AST (ACT) aminotransferase อะลานีน (ALT) การกำหนดระดับของ aminotransferases แบบไดนามิก bilirubin ในการรักษาผู้ป่วยวัณโรคโดยเฉพาะอย่างยิ่งในรูปแบบที่รุนแรงเป็นส่วนประกอบบังคับของการตรวจทางชีวเคมีของผู้ป่วยวัณโรคและดำเนินการเป็นรายเดือน

การประเมินสถานะการทำงานของไตรวมถึงการกำหนดระดับ creatinine ในซีรัมและการคำนวณอัตราการกรองไตเทียมตามสูตร Cockcroft-Gault การคำนวณอัตราการกรองไส้กรองไตโดยใช้ตัวอย่างของ Reberg จะให้ผลลัพธ์ที่ไม่ถูกต้อง

เป้าหมายหลักของการศึกษาทางชีวเคมีแบบไดนามิกของผู้ป่วยวัณโรคคือการตรวจสอบกระบวนการของกระบวนการการตรวจสอบผลข้างเคียงของยาอย่างทันท่วงทีและการแก้ไขปัญหา homeostatic disorders ที่เกิดขึ้นอย่างเพียงพอ

[17], [18], [19]

การใช้วิธีการทางชีวเคมีในการตรวจหาวัณโรคนอกวัณโรค

ตัวบ่งชี้ข้อมูลส่วนใหญ่คือเนื้อหาของกรด tuberculostearic ในของเหลวทางชีวภาพ แต่ความหมายของมันมีความเกี่ยวข้องกับปัญหาทางเทคนิค (ความจำเป็นในการใช้แก๊สโครมาโทกราฟีและเครื่องสเปกโตรมิเตอร์)

การวัดกิจกรรมของ adenosine deaminase - เอนไซม์ในของเหลว: synovial, pericardial, ascitic หรือ spinal ผู้ผลิตหลักของ deaminase adenosine คือ lymphocytes และ monocytes ความมุ่งมั่นของกิจกรรม deaminase adenosine ในของเหลวทางชีวภาพอำนวยความสะดวกในการวินิจฉัยของ synovitis วัณโรควัณโรคต่อมน้ำเหลืองที่เยื่อหุ้มสมองอักเสบวัณโรค serozity วัณโรค

ตัวชี้วัดทางชีวเคมีบางตัวเนื่องจากความจำเพาะที่ไม่เฉพาะเจาะจงของสารเหล่านี้จะถูกกำหนดเฉพาะในของเหลวที่มีชีวิตใกล้เคียงกับจุดโฟกัสของแผล วัดระดับของตัวบ่งชี้ในการตอบสนองต่อการฉีดวัคซีน tuberculin ทางผิวหนังหรือใต้ผิวหนัง (โดยปกติคือก่อนและหลัง 48 และ 72 ชั่วโมง) หลังจากนี้ระดับการเพิ่มขึ้นของระดับเครื่องหมาย (ใน%) จะคำนวณโดยพิจารณาจากระดับเริ่มต้น

การตรวจหาปัสสาวะของเอนไซม์ transamnidase ที่จำเพาะต่ออวัยวะที่เหมาะสมในปัสสาวะซึ่งลักษณะที่สังเกตได้จากการที่ไตได้รับผลกระทบจากลักษณะต่างๆ การศึกษาเกี่ยวกับยา transamidinase เป็นไปอย่างถูกต้องภายใต้เงื่อนไขของการฉีดวัคซีน tuberculin โดยการฉีดใต้ผิวหนังเพื่อทำให้กระบวนการอักเสบในท้องถิ่นรุนแรงขึ้น ตรวจสอบกิจกรรมของ transamidine ในปัสสาวะครั้งแรกและ 24-72 ชั่วโมงหลังจากการแนะนำของ tuberculin 50 TE การขยายตัวของเชื้อหมักใน 2 ครั้งขึ้นไปช่วยให้ใน 82% ของกรณีที่จะแยกความแตกต่างวัณโรคที่ใช้งานของไตจากอาการกำเริบของโรคระบบประสาทอ่อนเรื้อรัง

วัณโรคของอวัยวะสืบพันธุ์เพศหญิงวัณโรคอวัยวะสืบพันธุ์เพศหญิงมีความเข้มข้นของ haptoglobin และ maledicaldehyde ในเลือดในการทดสอบ tuberculin เร้าใจ ฉีดวัคซีนฉีดเข้าใต้ผิวหนังในขนาด 50 TE และ 72 ชั่วโมงหลังจากทำการศึกษาทางชีวเคมีครั้งที่สอง ในกรณีที่เกิดโรควัณโรคระดับการเพิ่มระดับฮอร์โมน haptoglobin ไม่น้อยกว่า 28% และระดับ malondialdehyde เท่ากับ 39% หรือมากกว่า การตรวจวัดความสามารถในการทำงานของ adenosine deaminase ในน้ำไขสันหลังอักเสบที่ได้จากพื้นที่ดักลาสยังใช้ ตรวจสอบซ้ำอีก 72 ชั่วโมงหลังจากได้รับ tuberculin ฉีดเข้ากล้ามเนื้อในขนาด 0.1 TE และ 0.01 TE ในการฉายอวัยวะภายในบริเวณผนังช่องท้องบริเวณหน้าท้อง ในกระบวนการวัณโรคการเพิ่มขึ้นของกิจกรรม adenosine deaminase คือ 10% หรือมากกว่าเมื่อเทียบกับครั้งแรก

เมื่อตาได้รับผลกระทบจะมีการตรวจสอบปฏิกิริยาโฟกัสที่เกิดขึ้นในตาเพื่อตอบสนองต่อการกระตุ้นแอนติเจน ไม่พึงปรารถนาในการพัฒนาการตอบสนองที่เด่นชัดพร้อมกับการลดลงของฟังก์ชันภาพ เนื่องจากการประเมินปฏิกิริยาโฟกัสที่น้อยที่สุดมักเป็นเรื่องยากสำหรับการสรุปข้อสรุปแนะนำให้จัดแนวขนานและระดับการเจริญเติบโตของซีรั่มในเลือดของ haptoglobin หรือ adenosine deaminase

ควรศึกษาชีวเคมีทั้งหมดร่วมกับวิธีการอื่น ๆ

[20], [21], [22], [23],

การศึกษาระบบการแข็งตัวของเลือด

ความสัมพันธ์กันของสถานะการวิจัยของระบบการแข็งตัวของเลือดวัณโรคเกิดจากการปรากฏตัวของจำนวนผู้ป่วยวัณโรคปอด haemoptysis หรือเลือดคั่งในปอดเช่นเดียวกับภาวะแทรกซ้อน hemocoagulation ในการผ่าตัดรักษาผู้ป่วยวัณโรค นอกจากนี้การไหลเวียนโลหิตที่ระแวดระวังของหลอดเลือดแดงภายในหลอดเลือดตามธรรมชาติซึ่งมาพร้อมวัณโรคยังส่งผลต่อการเกิดโรคและประสิทธิภาพของเคมีบำบัด

ในผู้ป่วยที่มีความชุกวัณโรคปอดขององค์ประกอบการอักเสบฟกช้ำจากการลดลงสังเกตในกิจกรรม anticoagulation เลือด ในผู้ป่วยที่มีความชุกต่ำของแผลที่เฉพาะเจาะจงในปอดที่มีความเด่นของ hemocoagulation ผลิตส่วนประกอบการอักเสบของหลอดเลือดที่แสดงเล็กน้อย ในผู้ป่วยวัณโรคปอดที่มีเลือดและรัฐตกเลือดระบบการแข็งตัวของเลือดในปอดจะแตกต่างกันในผู้ป่วยที่มีการสูญเสียในเลือดต่ำที่ gemoptoe สูงหรือทันทีหลังจากการสิ้นสุดของมันมีการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วในความสามารถในการแข็งตัวของเลือดเนื่องจากแรงที่รุนแรงของ trombinoobrazovaniya ขณะที่ยังคงเพิ่มขึ้น "โครงสร้าง" การแข็งตัว ในผู้ป่วยที่มีการสูญเสียเลือดขนาดใหญ่ที่มีศักยภาพสังเกตการแข็งตัวลดลงที่ค่าใช้จ่ายของการลดความเข้มข้นของ fibrinogen ที่ กิจกรรมของ Factor XIII การนับเกล็ดเลือด ในขั้นตอนของการผ่าตัดรักษาในผู้ป่วยที่มีรูปแบบที่ จำกัด ของวัณโรคปอดที่มีการละเมิดอย่างมีนัยสำคัญสภาวะสมดุลของระบบที่เกิดขึ้น ผู้ป่วยที่มีกระบวนการที่แพร่หลายในการดำเนินการของ pnevmon- หรือ plevropnevmonektomii บ่อยพัฒนา DIC ซึ่งสามารถใช้รูปแบบของ "โรคสอง."

ในการตรวจสอบสถานะของการแข็งตัวของเลือดในผู้ป่วยวัณโรคปอดที่ควรจะดำเนินการกำหนดเวลา thromboplastin เปิดใช้งานบางส่วน (aPTT) fibrinogen เวลา thrombin ดัชนี prothrombin และเวลามีเลือดออกและเวลาการแข็งตัว

[24], [25], [26], [27], [28]

การวิจัยฮอร์โมน

ข้อสังเกตการทดลองและทางคลินิกสมัยใหม่บ่งชี้ถึงการปรากฏตัวของการเปลี่ยนแปลงสถานะฮอร์โมนในการอักเสบของปอดโดยเฉพาะ tuberculous inflammation มันเป็นเรื่องที่พิสูจน์ให้เห็นว่าการแก้ไขของความผิดปกติของระบบต่อมใต้สมองต่อมไทรอยด์ต่อมใต้สมอง--ต่อมหมวกไตและการทำงานของตับอ่อนร่วมกับรักษาด้วยยาต้านวัณโรคนำไปสู่การเปิดใช้งานของ fibrogenesis และการซ่อมแซมอักเสบเฉพาะสถานที

สถานะการทำงานของระบบต่อมใต้สมองไทรอยด์จะถูกตัดสินโดยเนื้อหาในเลือดของ triiodothyronine (ที₃ ) thyroxine (T ₄ ) ต่อมใต้สมองต่อมไทรอยด์ฮอร์โมนกระตุ้น (TSH) มันก็พบว่าพร่องไม่แสดงอาการที่ตรวจพบใน 38-45% ของผู้ป่วยวัณโรคปอดและส่วนใหญ่มักจะได้รับการวินิจฉัยกระบวนการรูปแบบการเผยแพร่และ Fibro-โพรง ภายใต้รูปแบบเดียวกันนี้มากที่สุดระดับที่ลดลงอย่างมากของทั้งสอง T ₃และ T ₄และมีมาความไม่สมดุลของฮอร์โมนเหล่านี้ในรูปแบบของการเพิ่มอัตราส่วนของ T ที่₄ / T s

ฟังก์ชั่น adrenocortical ได้รับการประเมินจากระดับของ cortisol ในเลือดและฟังก์ชั่นต่อมไร้ท่อของตับอ่อน - ความเข้มข้นของอินซูลินภูมิคุ้มกันปฏิกิริยา ในระยะเฉียบพลันของโรคติดเชื้อจำเป็นที่จะต้องเพิ่ม cortisol ภายในและอินซูลินเพิ่มขึ้น hyperinsulinemia ยังพิสูจน์ถึงความต้านทานต่ออินซูลินของเนื้อเยื่อของร่างกายซึ่งเป็นปกติสำหรับกระบวนการอักเสบใด ๆ ที่ใช้งานโดยเฉพาะอย่างยิ่งเฉพาะ การตรวจหาหน้าที่ของ glucocorticoid ในต่อมหมวกไตที่มีวัณโรคปอดที่ใช้งานอยู่ช่วยให้สามารถเปิดเผยการปรากฏตัวของ hypercorticism ในผู้ป่วยส่วนใหญ่ได้ ระดับปกติของความเข้มข้นของเลือด cortisol ในผู้ป่วยที่มีการอักเสบติดเชื้อในช่วงเฉียบพลันควรจะถือว่าเป็นความล้มเหลวของการทำงาน glucocorticoid ของเยื่อหุ้มสมองต่อมหมวกไตที่สามารถใช้เป็นพื้นฐานสำหรับการถือครองปริมาณการบำบัดทดแทนเพียงพอของ glucocorticoids

เกือบหนึ่งในสามของผู้ป่วยที่มีวัณโรคในปอดสามารถระบุได้ว่าระดับอินซูลินในคนไข้นั้นต่ำมากและมีข้อ จำกัด ด้านล่างของบรรทัดฐานขณะที่ 13-20% สังเกต hyperinsulinism อย่างมีนัยสำคัญ ทั้งความสัมพันธ์ hypo- และ hyperinsulinism เป็นปัจจัยเสี่ยงสูงสำหรับการพัฒนาของการละเมิดการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรตในองศาที่แตกต่างกัน การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ในกิจกรรมการทำงานของเซลล์ B ของตับอ่อนต้องการการตรวจสอบระดับน้ำตาลในเลือดอย่างสม่ำเสมอในผู้ป่วยวัณโรคและการป้องกันโรคเบาหวานได้ทันท่วงที นอกจากนี้ นี้ทำหน้าที่เป็นเหตุผลเพิ่มเติมเพื่อความสะดวกในการใช้สรีรวิทยาของปริมาณอินซูลินในการบำบัดที่ซับซ้อนของวัณโรค

โดยทั่วไประดับล่างของฮอร์โมนไทรอยด์และ hypercortisolemia ความไม่สมดุลของพวกเขาและการเข้าถึง hyperinsulinism ยิ่งใหญ่ที่สุดในผู้ป่วยที่มีการเรียนการสอนอย่างรุนแรงของกระบวนการวัณโรคมีความเสียหายอย่างกว้างขวางและปอดอาการรุนแรงของวัณโรคมึนเมา

การวินิจฉัยโรควัณโรคด้วยจุลินทรีย์

การศึกษาทางจุลชีววิทยาที่มีความจำเป็นในตัวของผู้ป่วยวัณโรคในการตรวจสอบของการวินิจฉัยการตรวจสอบและแก้ไขยาเคมีบำบัดการประเมินผลการรักษาในคำอื่น ๆ ตั้งแต่การลงทะเบียนของผู้ป่วยวัณโรคก่อนที่จะถอดมันออกมาจากรีจิสทรี

ทุกโครงการระบาดวิทยาและโปรแกรมบนพื้นฐานของการประมาณจำนวนแบคทีเรียที่ที่ไม่สามารถทำได้โดยไม่ต้องใช้เทคนิคในห้องปฏิบัติการในการระบุเชื้อวัณโรค ในการศึกษาการดูดซึมของสิ่งที่เรียกว่าร้อยละของประชากรไม่มีการรวบรวมของแบคทีเรียถึง 70 หรือมากกว่าซึ่งทำให้วิธีการตรวจทางห้องปฏิบัติการวิธีที่มีประสิทธิภาพมากกว่าการระบุผู้ป่วยวัณโรคในกลุ่มประชากรกลุ่มนี้

วิธีการทางจุลชีววิทยาแบบดั้งเดิมสำหรับการวินิจฉัยวัณโรคคือการศึกษาทางแบคทีเรียและทางวัฒนธรรม วิธีการที่ทันสมัยพิจารณาการเพาะปลูก mycobacterium tuberculosis ในระบบอัตโนมัติการตั้ง PCR อย่างไรก็ตามวิธีการทั้งหมดเหล่านี้จำเป็นต้องใช้ร่วมกับวิธีการทางแบคทีเรียแบบคลาสสิก

คอลเลกชันของวัสดุการวินิจฉัย

ประสิทธิภาพของการศึกษาในห้องปฏิบัติการขึ้นอยู่กับคุณภาพของวัสดุการตรวจวินิจฉัย การปฏิบัติตามกฎสำหรับการจัดเก็บจัดเก็บและขนส่งวัสดุการวินิจฉัยและการใช้ขั้นตอนการประเมินผู้ป่วยอย่างถูกต้องมีผลโดยตรงต่อผลลัพธ์และเพื่อให้มั่นใจถึงความปลอดภัยทางชีวภาพ

สำหรับการทดสอบเกี่ยวกับวัณโรคมีการใช้วัสดุหลายอย่าง เนื่องจากความจริงที่ว่าวัณโรค logkih- รูปแบบที่พบมากที่สุดแผลวัณโรค, วัสดุพื้นฐานสำหรับการวิจัยพิจารณาเสมหะและประเภทอื่น ๆ tracheobronchial ถอดออก: บนหลั่งระบบทางเดินหายใจได้รับหลังจากละอองสูดดม: ล้างหลอดลม; น้ำยาบ้วนปาก วัสดุที่ได้จากการ bronchoscopy และ transtracheal intrapulmonary ขริบจาก aspirates หลอดลมกล่องเสียง swabs, exudates จากบาดแผลและรอยเปื้อนอัล

ประสิทธิผลของการวิจัยเพิ่มขึ้นถ้ามีการเก็บรวบรวมวัสดุที่ควบคุมจากผู้ป่วย เพื่อวัตถุประสงค์นี้ห้องที่มีอุปกรณ์ครบครันจะมีการจัดสรรหรือซื้อแท็กซี่พิเศษ การเก็บรวบรวมวัสดุเป็นขั้นตอนที่เป็นอันตรายดังนั้นจึงจำเป็นต้องเก็บรวบรวมข้อมูลเพื่อการวิจัยโดยปฏิบัติตามกฎความปลอดภัยที่ติดเชื้อ

วัสดุสำหรับการทดสอบเชื้อวัณโรค mycobacterium ถูกเก็บในขวดที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยฝาเกลียวเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของสิ่งแวดล้อมและปกป้องวัสดุที่เก็บจากการปนเปื้อน

ขวดสำหรับเก็บวัสดุตรวจวินิจฉัยต้องเป็นไปตามข้อกำหนดต่อไปนี้:

• ต้องทำจากวัสดุทนแรงกระแทก
• ควรละลายได้ง่ายระหว่างการตกตะกอน
• มีปริมาณเพียงพอ (40-50 มิลลิลิตร):
• มีช่องเปิดกว้างสำหรับการเก็บเสมหะ (เส้นผ่าศูนย์กลางไม่น้อยกว่า 30 มม.);
• ง่ายต่อการจัดการโปร่งใสหรือโปร่งแสงเพื่อให้คุณสามารถประเมินปริมาณและคุณภาพของตัวอย่างที่เก็บได้โดยไม่ต้องเปิดฝา

เพื่อให้ได้ผลการวิจัยที่ดีที่สุดต้องปฏิบัติตามเงื่อนไขต่อไปนี้:

• รวบรวมวัสดุก่อนเริ่มเคมีบำบัด
• วัสดุสำหรับการศึกษาจะต้องเก็บก่อนที่จะรับประทานอาหารเช้าและยา;
• สำหรับการวิจัยเป็นที่พึงประสงค์ในการเก็บรวบรวมอย่างน้อย 3 ตัวอย่างของเสมหะในตอนเช้า ให้เสมหะเป็นเวลา 3 วันติดต่อกัน
• ต้องจัดส่งวัสดุที่เก็บรวบรวมไปยังห้องปฏิบัติการให้เร็วที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้:
• ในกรณีที่ไม่สามารถจัดส่งวัสดุไปยังห้องปฏิบัติการได้ทันทีจะจัดเก็บในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาไม่เกิน 48 ชั่วโมง
• เมื่อขนถ่ายวัสดุจำเป็นต้องตรวจสอบความสมบูรณ์ของขวดอย่างใกล้ชิด

เสมหะที่เก็บได้อย่างถูกต้องคือเมือกหรือมีเลือดคั่ง ปริมาณเสมหะที่เหมาะสมที่สุดคือ 3-5 มิลลิลิตร

เสมหะเก็บภายใต้การดูแลของแพทย์มืออาชีพ บุคคลที่รับผิดชอบในการเก็บเสมหะควรเป็นไปตามการปฏิบัติตามกฎบางอย่าง:

• จำเป็นต้องอธิบายให้ผู้ป่วยทราบถึงวัตถุประสงค์ของการศึกษาและความจำเป็นในการไอไม่ให้น้ำลายหรือน้ำมูกเกี่ยวกับโพรงจมูก แต่เนื้อหาของระบบทางเดินหายใจส่วนลึก นี้สามารถเกิดขึ้นได้เป็นผลมาจากไอที่มีประสิทธิผลที่เกิดขึ้นหลังจากหลาย (2-3) ลมหายใจลึก นอกจากนี้ยังจำเป็นต้องเตือนผู้ป่วยว่าควรล้างปากด้วยน้ำต้มเพื่อขจัดส่วนหลักของจุลินทรีย์ที่เป็นมังสวิรัติในช่องปากและเศษอาหารที่ขัดขวางการตรวจเสมหะ
• แพทย์ที่เข้าร่วมในการเก็บเสมหะนอกเหนือจากเสื้อคลุมอาบน้ำและหมวกต้องสวมหน้ากากถุงมือยางและผ้ากันเปื้อนยาง
• ยืนอยู่ข้างหลังผู้ป่วยที่เขาจะแนะนำให้เก็บขวดให้ใกล้เคียงกับริมฝีปากของเขาและทันทีที่แยกออกเป็นมันเสมหะขณะที่มันไอและจะต้องมีการระบุว่าการไหลของอากาศเป็นผู้กำกับให้ห่างจากเจ้าหน้าที่สาธารณสุข:
• เมื่อเสร็จสิ้นการเก็บเสมหะแล้วเจ้าหน้าที่สาธารณสุขควรปิดขวดอย่างใกล้ชิดพร้อมฝาปิดและประเมินปริมาณและคุณภาพของเสมหะที่เก็บ จากนั้นขวดจะถูกติดฉลากและวางไว้ใน bix พิเศษสำหรับการขนส่งไปยังห้องปฏิบัติการ

ถ้าผู้ป่วยไม่ได้ผลิตเสมหะคืนก่อนและในช่วงเช้าของวันที่คอลเลกชันของวัสดุที่จำเป็นในการให้เขาเสมหะ :. สารสกัดจากรากของขนมหวาน (mukaltin) ยาบรอมเฮกซีน, Ambroxol ฯลฯ - หรือใช้การสูดดมระคายเคืองโดยใช้อุปกรณ์ที่ติดตั้งในห้องพักในการเก็บรวบรวม เสมหะ วัสดุที่เก็บรวบรวมได้ด้วยวิธีนี้ไม่อยู่ภายใต้การอนุรักษ์และควรได้รับการตรวจสอบในวันที่เก็บ เพื่อหลีกเลี่ยงการ "ฆ่าเชื้อ" ในห้องปฏิบัติการในทิศทางควรทำเครื่องหมายพิเศษ

หากสถานที่นี้ไม่ได้ดำเนินการตรวจสอบทางจุลชีววิทยาเก็บรวบรวมวัสดุวินิจฉัยที่จะจัดส่งจากส่วนกลางไปยังห้องปฏิบัติการที่ผู้ประกอบการจะต้องบันทึกวัสดุที่ใช้ในระหว่างการส่งมอบในตู้เย็นหรือโดยการใช้สารกันบูด จัดส่งวัสดุไปยังห้องปฏิบัติการในกล่องขนส่งซึ่งสามารถฆ่าเชื้อได้ง่าย ตัวอย่างควรมีฉลากที่เหมาะสมและควรมีฉลากที่ประกอบไปด้วย

[29], [30], [31],

รูปแบบและความถี่ในการตรวจร่างกายของผู้ป่วย

ในการตรวจวินิจฉัยผู้ป่วยวัณโรคที่เรียกว่าการตรวจวินิจฉัยเบื้องต้นผู้ป่วยจำเป็นต้องตรวจเสมหะอย่างน้อย 3 ครั้งเป็นเวลา 2 หรือ 3 วัน รวบรวมภายใต้การดูแลของบุคลากรทางการแพทย์ซึ่งจะเพิ่มประสิทธิภาพของกล้องจุลทรรศน์

การตรวจคัดกรองเบื้องต้นสำหรับวัณโรคควรดำเนินการโดยสถาบันการวินิจฉัยทางการแพทย์ทั้งหมดของระบบการดูแลสุขภาพ เมื่อเร็ว ๆ นี้ได้มีการจัดศูนย์กล้องจุลทรรศน์ที่ติดตั้งกล้องจุลทรรศน์ที่ทันสมัยและอุปกรณ์เพื่อความปลอดภัยในการแพร่ระบาดขึ้นโดยได้มีการจัดห้องทดลองทางคลินิกเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพในการตรวจครั้งแรก

สิ่งอำนวยความสะดวกในการป้องกันโรควัณโรคจะใช้การตรวจคัดกรองซึ่งรวมถึงการตรวจเสมหะหรือวัสดุตรวจอื่น ๆ อย่างน้อย 3 ครั้งเป็นเวลา 3 วัน ในระหว่างการรักษาการศึกษาทางจุลชีววิทยาจะดำเนินการอย่างสม่ำเสมออย่างน้อยเดือนละครั้งในระยะเคมีบำบัดเข้มข้น ในช่วงการเปลี่ยนไปใช้ระยะการรักษาการศึกษาจะดำเนินการน้อยกว่าโดยมีช่วงเวลา 2-3 เดือนในขณะที่ความถี่ของการศึกษาลดลงเหลือสองครั้ง

คุณลักษณะของการเก็บรวบรวมวัสดุการวินิจฉัยสำหรับวัณโรคนอกวัณโรค

มีวัสดุทางพยาธิวิทยาที่มีรูปแบบนอกปอดวัณโรค - เชื้อวัณโรคเข้มข้นต่ำในนั้นซึ่งต้องใช้วิธีการที่สำคัญมากของการศึกษาทางจุลชีววิทยาส่วนใหญ่ในสื่อเทคนิคการเพาะ

ด้วยการเป็นวัณโรคของระบบทางเดินปัสสาวะปัสสาวะเป็นวัสดุการศึกษาที่สามารถเข้าถึงได้มากที่สุด การเก็บปัสสาวะควรทำโดยพยาบาลที่ได้รับการฝึกฝนมาเป็นพิเศษ

องคชาตภายนอกถูกล้างด้วยน้ำด้วยสบู่หรือสารละลายด่างทับทิมอ่อนแอ การเปิดทางเดินปัสสาวะภายนอกจะได้รับการรักษาอย่างรอบคอบ ในขวดที่ปราศจากเชื้อจะมีการเก็บรวบรวมปัสสาวะตอนเช้าโดยเฉลี่ยในผู้ชายโดยธรรมชาติในสตรีโดยใช้สายสวน ปัสสาวะจากกระดูกเชิงกรานไตจะถูกเก็บรวบรวมไว้ในหลอดที่ไม่มีการฆ่าเชื้อด้วยการถ่ายอุจจาระของไตอย่างน้อยหนึ่งไตหรือสองไตในกรณีหลัง - จำเป็นต้องแยกออกจากไตแต่ละครั้ง ปัสสาวะปัสสาวะจำนวนเล็กน้อยจะถูกปั่นแยกออกจากตะกอน

ในผู้ชายอสุจิตวัดอัณฑะความลับของต่อมลูกหมากต้องผ่านการหมุนเหวี่ยงเพื่อให้ได้ตะกอน ด้วยการแปลเฉพาะของกระบวนการเฉพาะในพื้นที่อวัยวะเพศชาย, การนวดต่อมลูกหมากสามารถส่งเสริมการหลั่งของสารคัดหลั่งที่มี mycobacterium tuberculosis.

เลือดประจำเดือนในสตรีถูกเก็บโดยการดูดหรือใช้หมวก Kafka วัสดุที่ได้รับจะปลดปล่อยออกมาจากเซลล์เม็ดเลือดแดงล้างด้วยน้ำกลั่นตามด้วยการหมุนเหวี่ยง การตรวจสอบการตกตะกอน

การจัดสรรจากช่องคลอดของมดลูกจะถูกเก็บรวบรวมด้วยความจุหรือฝาครอบบางส่วนของ Kafka นั่นคือเป็นที่พึงปรารถนาที่จะสะสมสารพยาธิสภาพ 1-2 มิลลิลิตร

วัสดุที่ได้จากการผ่าตัดแทรกแซงในไต, อวัยวะเพศ การตัดชิ้นเนื้อจากเยื่อบุโพรงมดลูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน เมื่อต้องการทำเช่นนี้ก็จะถูกวางไว้ในปูนหมันและบดละเอียดด้วยกรรไกรปลอดเชื้อ เพื่อให้สารละลายนี้ถูกบันทึกอยู่ในทรายแม่น้ำหมันในจำนวนเท่ากับน้ำหนักของมันแล้วเติมด้วย 0,5-1.0 มิลลิลิตร isotonic โซเดียมคลอไรด์และทุกอย่างถูก triturated จนกว่ามวลซีดขาวด้วยนอกเหนือจากการแก้ปัญหา isotonic โซเดียมคลอไรด์ (4-5 มล.) จากนั้นให้ทำการชั่งน้ำหนัก 1-1.5 นาทีเพื่อตรวจสอบสารดังกล่าว

วัณโรคของกระดูกและข้อต่อ เข็มฉีดยาที่ปราศจากเชื้อ (punctate) จะถูกนำไปใส่ในอาหารที่ปราศจากเชื้อและส่งมอบให้กับห้องปฏิบัติการทันที ปัสสาวะปราศจากเชื้อก่อนหน้านี้ชุบสารละลายโซเดียมคลอไรด์โซเดียมคลุกเคล้าให้ใช้หนอง 2-5 มิลลิลิตรถ่ายโอนไปยังขวดเม็ดและใส่สารละลายโซเดียมคลอไรด์อีก 2 มล. ขวดปิดด้วยไม้ก๊อกและเขย่าในเครื่องโจ๊กเกอร์ประมาณ 8-10 นาที มีการตรวจสอบการระงับการทำ homogenized

ในรูปแบบที่กำเริบของวัณโรคเกี่ยวกับข้อเข่าเสื่อมจะมีหนองจากรูพรุน การปลดปล่อยสารปนเปื้อนจะถูกเก็บรวบรวมโดยตรงในหลอดทดลอง ในกรณีทวารรำมะนาดยันล้างด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์เป็นหมัน isotonic และซักถูกรวบรวมลงในหลอดทดสอบหรือชิ้นส่วนของสำลีชุบด้วยหนองส่งสำหรับการวิเคราะห์

วัสดุผ่าตัดที่ได้รับในระหว่างการผ่าตัดแทรกแซงกระดูกและข้อต่ออาจประกอบด้วยมวลที่เป็นหนอง - เรื้อรังเนื้อเยื่อแผลเป็นเนื้อเยื่อกระดูกเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มเซลล์และพื้นผิวอื่น ๆ การรักษาจะดำเนินการเช่นเดียวกับวัณโรคของไต

การตรวจสอบจุลินทรีย์ของของเหลวในน้ำไขข้อในสารละลายโซเดียมซิเตรต (อัตราส่วน 1: 1) เพื่อแก้ปัญหาการแข็งตัวของเลือดในทันทีหลังการเจาะ

วัณโรคของต่อมน้ำหลือง หนองที่สกัดในระหว่างการเจาะของต่อมน้ำหลืองนอกจากนี้ยังมีการตรวจสอบ เป็นหนองของ abscesses เนื้อเยื่อของต่อมน้ำหลืองที่ได้รับระหว่างการแทรกแซงการผ่าตัดการตรวจชิ้นเนื้อตรวจสอบเช่นเดียวกับวัณโรครูปแบบอื่น ๆ

การศึกษาอุจจาระของเชื้อวัณโรค mycobacterium มีน้อยมากเนื่องจากการขาดผลบวกเกือบทั้งหมด

[32], [33], [34], [35], [36],

กล้องจุลทรรศน์ Mycobacterium

กล้องจุลทรรศน์เสมหะเป็นวิธีการที่ค่อนข้างรวดเร็วง่ายและไม่แพงที่ควรใช้ในทุกกรณีที่มีวัณโรคที่สงสัย นอกจากนี้การศึกษานี้มีขึ้นเพื่อประเมินประสิทธิภาพของเคมีบำบัดและเพื่อให้แน่ใจว่าการฟื้นตัวหรือความล้มเหลวของการรักษาถ้าไม่มีการทดสอบทางวัฒนธรรม

ใช้วิธีการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์สองวิธี:

• วิธีส่องกล้องจุลทรรศน์โดยตรงเมื่อมีการเตรียมสารผสมจากวัสดุตรวจวินิจฉัย
• วิธีการของกล้องจุลทรรศน์ของตะกอนที่เตรียมจากสารที่ปนเปื้อนเพื่อการเพาะเลี้ยง

วิธีการแรกถูกนำมาใช้ในห้องปฏิบัติการเหล่านั้นซึ่งดำเนินการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ (ห้องปฏิบัติการทางคลินิกและห้องปฏิบัติการวินิจฉัยของเครือข่ายทางการแพทย์ทั่วไป)

ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดของการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์จะได้จากการเน้นวัสดุการวินิจฉัย (ตัวอย่างเช่นโดยการหมุนเหวี่ยง)

ในการตรวจหาเชื้อวัณโรคด้วยความน่าจะเป็น 50% เมื่อทำการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ให้เสมหะ 1 มิลลิลิตรควรมีเซลล์จุลินทรีย์มากกว่า 5,000 ตัว เสมหะของผู้ป่วยที่มีรูปแบบของวัณโรคในปอดมักจะมีแบคทีเรียที่เป็นกรดอย่างรวดเร็วซึ่งช่วยให้สามารถตรวจพบแบคทีเรียได้อย่างน่าเชื่อถือ ความไวในการวินิจฉัยของวิธีการนี้สามารถปรับปรุงได้โดยการตรวจหาเสมหะหลายตัวอย่างจากผู้ป่วยรายหนึ่ง ผลลบของการตรวจ bacterioscopic ไม่ได้ยกเว้นการวินิจฉัยวัณโรคเนื่องจากเสมหะของผู้ป่วยบางรายมีแบคทีเรียน้อยกว่าสามารถตรวจพบได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ การเตรียมเสมหะไม่ดีอาจทำให้เกิดการติดเชื้อแบคทีเรียในทางลบ

วิธีที่ใช้กันทั่วไปในการตรวจหาเชื้อแบคทีเรียที่เป็นกรดในคราบจุลินทรีย์เป็นสีตามมาตรฐาน Tsiol-Nelsen วิธีนี้ขึ้นอยู่กับการแทรกซึมของ carbolic fuchsin เข้าไปในเซลล์จุลินทรีย์ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่มีชั้นของ waxy-lipid ขณะที่ความร้อนและการกัดกร่อนของฟีนอลในเวลาเดียวกัน การเปลี่ยนสีของคราบรอยเปื้อนด้วยกรดซัลฟิวริกหรือสารละลายกรดไฮโดรคลอริกร้อยละ 25 ทำให้เกิดการเปลี่ยนสีของโครงสร้างที่ไม่เป็นกรดได้อย่างรวดเร็ว องค์ประกอบที่เปลี่ยนสีของรอยเปื้อนจะถูกย้อมสีด้วยสารละลาย methylene blue 0.3% Mycobacteria ไม่รับรู้สีย้อม Aniline ตามปกติอันเป็นผลมาจากการที่แบคทีเรียที่เป็นกรดได้รวดเร็วมีคราบสีแดงเข้มและจุลินทรีย์อื่น ๆ และส่วนประกอบของเซลล์สีฟ้า

สำหรับรอยเปื้อนเปรอะเปื้อนโดย Ziehl-Nelsenu ใช้กล้องจุลทรรศน์สองตาแสงที่มีการแช่น้ำมันเลนส์ (เพิ่มขึ้น 90 หรือ 100 เท่า) และช่องมองภาพเพื่อขยาย 7- หรือ 10 เท่า สำรวจเขตข้อมูลการมองเห็น 100 แห่งซึ่งเพียงพอที่จะระบุ mycobacteria เดียวในการ smear ในกรณีที่ผลการศึกษาดังกล่าวเป็นลบดังนั้นเพื่อยืนยันขอแนะนำให้ดูอีก 200 วิสัยทัศน์ บันทึกผลลัพธ์ระบุจำนวนแบคทีเรียที่เป็นกรดได้รวดเร็ว (KUM)

นอกเหนือจากเทคนิคนี้แล้วยังใช้ fluorochromes สีสำหรับกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด การใช้วิธีนี้ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของกล้องจุลทรรศน์ได้ 10-15% เมื่อรักษา mycobacteria ด้วยสารเรืองแสง (auramine, rhodamine เป็นต้น) สารเหล่านี้จะผูกมัดกับโครงสร้างของขี้ผึ้งของเซลล์จุลินทรีย์ เมื่อมีการฉายรังสีเซลล์ที่มีแหล่งกำเนิดแสงที่น่าตื่นเต้น (คลื่นความถี่รังสีอัลตราไวโอเลตบางส่วน) พวกเขาจะเริ่มเรืองแสงด้วยแสงสีแดงส้มหรือสว่างบนพื้นหลังสีเขียวสีดำหรือสีเข้ม เนื่องจากความสว่างและความคมชัดสูงของภาพที่มองเห็นได้การขยายภาพโดยรวมของกล้องจุลทรรศน์จะลดลง 4-10 เท่าขอบเขตการมองกว้างขึ้นและเวลาในการดูภาพของการเตรียมการลดลง นอกจากนี้เนื่องจากความลึกมากขึ้นของเขตข้อมูลคุณสามารถเพิ่มความสะดวกสบายของการศึกษา

เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเพื่อดูพื้นที่เดียวกันรอยเปื้อนจะใช้เวลาน้อยกว่าการใช้กล้องจุลทรรศน์แสงในการย้อมสี Tsiol-Nelsen ถ้าในวันทำงานกล้องจุลทรรศน์ตรวจสอบประมาณ 20-25 รอยเปื้อนเช่นนั้นด้วยความช่วยเหลือของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่เขาสามารถตรวจสอบมากกว่า 60-80 ตัวอย่างในเวลาเดียวกัน กล้องจุลทรรศน์ที่มีประสบการณ์ทราบว่าการผสมสีของเซลล์ด้วยส่วนผสมของ auramine และ rhodamine เป็นวิธีที่เฉพาะเจาะจงกับแบคทีเรียที่เป็นกรดได้อย่างรวดเร็วซึ่งในกรณีนี้มีลักษณะคล้ายกับแท่งสีทอง Saprophytes จะทาสีด้วยสีเขียว

อีกประโยชน์ที่สำคัญของวิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง - ความสามารถในการตรวจหาเชื้อเปลี่ยนแปลงหายไปภายใต้อิทธิพลของปัจจัยที่ไม่พึงประสงค์รวมทั้งการรักษาด้วยเคมีบำบัดอย่างเข้มข้นคุณสมบัติ kislotousotoychivosti และไม่ได้ตรวจพบในการเชื่อมต่อกับการย้อมสีนี้ Ziehl-Nelsenu

ข้อเสียของวิธีการของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงรวมถึงค่าใช้จ่ายที่ค่อนข้างสูงของกล้องจุลทรรศน์และการทำงานของมัน อย่างไรก็ตามในห้องปฏิบัติการส่วนกลางขนาดใหญ่หรือห้องปฏิบัติการขนาดใหญ่อื่น ๆ ที่โหลดเกินกว่ามาตรฐานของช่างเทคนิคห้องปฏิบัติการ 3 คนที่ทำงานร่วมกับกล้องจุลทรรศน์แบบเดิม 3 กล้องราคาถูกกว่าที่จะใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเดียวแทน

วิธีการแบคทีเรียมีความจำเพาะสูง (89-100%) ประมาณ 97% ของผลบวกที่ได้จากวิธีการใด ๆ ของกล้องจุลทรรศน์ได้รับการยืนยันอย่างไม่น่าสงสัยโดยผลของการหว่าน

ควรสังเกตว่าเมื่อทำการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ของวัสดุที่เป็นพยาธิวิทยาจะไม่สามารถระบุชนิดของเชื้อแบคทีเรียที่เป็นกรดได้อย่างรวดเร็ว วิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์ช่วยให้การให้ความเห็นเฉพาะในการมีหรือไม่มีของกรดในการเตรียมการของเชื้อจุลินทรีย์ซึ่งสามารถอธิบายได้ด้วยการดำรงอยู่ในธรรมชาติของจำนวนมากของสัณฐานคล้ายกับเชื้อมัยโคแบคทีเรียวัณโรคเชื้อจุลินทรีย์ที่ซับซ้อน nontubercular ทนกรด

ผลของกล้องจุลทรรศน์ได้รับการประเมินในหน่วยกึ่งเชิงปริมาณ

เพื่อให้สามารถเปรียบเทียบผลของวิธีการต่างๆของกล้องจุลทรรศน์สัมประสิทธิ์เชิงประจักษ์จะนำมาใช้ ตัวอย่างเช่นในการเปรียบเทียบผลของรอยเปื้อนย้อมด้วยสีเรืองแสง, กล้องจุลทรรศน์แสงวิจัยข้อมูล (1000 ครั้งขยาย) ก็เป็นสิ่งจำเป็นที่จะแบ่งจำนวนแบคทีเรียกรดอย่างรวดเร็วตรวจพบโดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่ค่าสัมประสิทธิ์ที่สอดคล้องกันที่กำลังขยาย 250 เท่า - 10 450 เท่า - ถึง 4, 630 เท่า - ถึง 2

คุณสมบัติของกล้องจุลทรรศน์สำหรับวัณโรคนอกวัณโรค

ใช้กล้องจุลทรรศน์โดยตรงและกล้องจุลทรรศน์ของรอยเปื้อนที่เตรียมหลังจากการตกแต่งแล้วตามด้วยการย้อมสี Tsiol-Nelsen หรือสีเรืองแสง กล้องจุลทรรศน์ของรอยเปื้อนโดยตรงไม่ได้ผลเนื่องจากความเข้มข้นต่ำของเชื้อ mycobacteria ในวัสดุดังนั้นจึงมีเหตุผลมากที่จะใช้วิธีการในการเสริมสมรรถภาพ มีประสิทธิภาพมากที่สุดคือการหมุนเหวี่ยง ถ้าวัสดุทางชีวภาพมีความหนืดการหมุนเหวี่ยงถูกใช้กับการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและการทำให้เป็นของเหลวพร้อมกันซึ่งจะดำเนินการโดยใช้เครื่องปั่นแยกความเร็วสูงที่มีแรงเหวี่ยง 3000 กรัมและสารละลายไฮโปคลอไรท์ ปัจจุบันยังไม่ได้ใช้วิธีการอื่น ๆ ในการเสริมสมรรถนะเช่นการลอยแบบจุลภาคเนื่องจากการก่อตัวของละอองลอยที่เป็นอันตรายต่อชีวภาพ

[37], [38],

วิธีการทางวัฒนธรรมของการวินิจฉัยวัณโรค

วิธีการหว่านหรือวิธีการเพาะเลี้ยงมีความไวต่อการส่องกล้องและมีข้อดีกว่าหลัง ช่วยให้สามารถตรวจจับเชื้อแบคทีเรีย Mycobacteria ได้หลายพันชนิดในวัสดุที่ทดสอบและมีค่าการวินิจฉัยที่ดี นี่เป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งเมื่อทำการตรวจสอบวัสดุจากผู้ป่วยที่เพิ่งได้รับการวินิจฉัยหรือได้รับการรักษาที่ปล่อย mycobacteria จำนวนน้อย

เมื่อเปรียบเทียบกับการใช้กล้องจุลทรรศน์แล้วการวิจัยทางวัฒนธรรมช่วยให้ผู้ป่วยวัณโรคได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคมากกว่า 15-25% รวมทั้งตรวจสอบวัณโรคในระยะก่อนหน้านี้เมื่อโรคยังสอดคล้องกับการรักษา ข้อได้เปรียบที่สำคัญอย่างยิ่งของการทดสอบวัฒนธรรมคือความเป็นไปได้ที่จะได้รับวัฒนธรรมกระตุ้นซึ่งสามารถระบุและศึกษาเกี่ยวกับความไวความรุนแรงความรุนแรงและคุณสมบัติทางชีวภาพอื่น ๆ ได้

ข้อเสียของวิธีการเพาะปลูก ได้แก่ ระยะเวลา (ระยะเวลารอคอยของวัสดุถึง 10 สัปดาห์) ความซับซ้อนของการประมวลผลของวัสดุการวินิจฉัย

หลักการเบื้องต้นในการรักษาวัสดุการตรวจวินิจฉัย

วิธีทางจุลชีววิทยาแบบเดิมไม่สามารถใช้ในการศึกษาเกี่ยวกับวัณโรค นี่เป็นเพราะความเป็นจริง วัณโรคที่เติบโตขึ้นอย่างช้า ๆ และตัวอย่างทางคลินิกส่วนใหญ่มีเชื้อจุลินทรีย์ที่เป็นตัวทำละลายและจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดการย่อยสลายรวดเร็วเชื้อรา การเจริญเติบโตอย่างรวดเร็วของพวกเขาในสื่ออาหารที่อุดมสมบูรณ์รบกวนการพัฒนา mycobacteria และไม่อนุญาตให้แยกสารก่อให้เกิดวัณโรคดังนั้นวัสดุการวินิจฉัยจะต้องได้รับการทำ pretreated ก่อนการเพาะ นอกจากนี้ mycobacteria ที่ปล่อยออกมาจากทางเดินหายใจของผู้ป่วยมักถูกล้อมรอบด้วยเมือกจำนวนมากซึ่งทำให้ยากที่จะให้ความสนใจกับพวกเขา ในเรื่องนี้ก่อนที่จะปลูกเสมหะและวัสดุที่คล้ายคลึงกันอื่น ๆ จำเป็นต้องมีการทำให้เป็นของเหลวและการปนเปื้อน

ผงซักฟอกและ decontamins มีฤทธิ์เป็นพิษต่อเชื้อ mycobacteria มากหรือน้อย อันเป็นผลมาจากการประมวลผลได้ถึง 90% ของ mycobacteria สามารถตายได้ เพื่อให้เพียงพอของประชากรเชื้อประหยัดจำเป็นที่จะต้องใช้เทคนิคการประมวลผลที่ช่วยให้บนมือข้างหนึ่งเพื่อให้การปราบปรามการเติบโตอย่างรวดเร็วแบคทีเรีย pyogenic และเน่าเหม็นและที่อื่น ๆ - เพื่อรักษาชีวิตของเชื้อมัยโคแบคทีเรียที่มีอยู่ในวัสดุที่

ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับวัสดุที่ระดับของความเป็นเนื้อเดียวกันและมลพิษสำหรับก่อนการประมวลผลโดยใช้ decontaminant ต่างๆ: เสมหะ - 4% โซเดียมแก้ปัญหาไฮดรอกไซโซลูชั่น trohzameschonnogo โซเดียมฟอสเฟต 10% benzalkonium คลอไรด์ไตรโซเดียมฟอสเฟต NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteine โซเดียมไฮดรอกไซ) ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1% NaOH ในปัสสาวะและวัสดุของเหลวอื่น ๆ - สารละลายกรดซัลฟูริก 3% สำหรับตัวอย่างที่ปนเปื้อนวัสดุที่มีไขมัน - วิธีการแก้ปัญหาของกรดออกซาลิกถึง 5% นอกจากนี้ในบางกรณียังใช้เอนไซม์ surfactants (ผงซักฟอก) การประยุกต์ใช้ผงซักฟอก Tween และบางส่วนตายเชื้ออื่น ๆ ที่จะมาพร้อมกับเซลล์น้อย (40-50% อยู่รอด) อย่างไรก็ตามสามารถใช้ได้เฉพาะกับของเหลวเท่านั้น การกระจายที่ใหญ่ที่สุดในโลกคือ NALC-NaOH ผลิตในชุด วิธีนี้ช่วยให้สามารถจัดสรรมากกว่า 85% ของจำนวนประชากรของเซลล์ mycobacterial ของแข็งที่ปนเปื้อน tkanesoderzhaschih ยากที่จะคาดเดาเพราะระดับของการกระจายตัวของวัสดุที่เป็นเนื้อเดียวกันในช่วงที่ยากลำบาก ยกตัวอย่างเช่นการตรวจชิ้นเนื้อรักษาต่อมน้ำเหลืองมักจะมาพร้อมกับความถี่ที่เพิ่มขึ้นของการปนเปื้อนของพืชภายนอก ในกรณีนี้สามารถใช้อีธานอนิกได้ 1%

วัสดุที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกันถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันกับเม็ดแก้วเมื่อมีสารปนเปื้อน วัสดุที่เป็นของเหลวมีการหดตัวก่อนและมีการตกตะกอนเท่านั้น

เทคนิคการหว่านและการบ่มเพาะ

หลังจากการปรับสภาพวัสดุจะถูกปั่นแยกจากกันทำให้เกิดการตกตะกอนของแบคทีเรียและเพิ่มปริมาณของสารในตะกอน ("enrichment sludge") สารตกตะกอนที่เกิดจะถูกทำให้เป็นกลางและฉีดวัคซีน (เชื้อ) กับสารอาหารที่ร่วนหรือหลอดที่มีสื่อเหลว (semiliquid) จากส่วนที่เหลือของตะกอนแผลจะเตรียมไว้สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ เทคนิคการเพาะเมล็ดควรป้องกันการปนเป cross cross อนข้ามของวัสดุการตรวจวินิจฉัย

สำหรับการตีความทางคลินิกที่เชื่อถือได้ของผลการศึกษาทางจุลชีววิทยาต้องปฏิบัติตามกฎต่อไปนี้: การศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์และการเพาะเลี้ยงต้องทำควบคู่ไปกับตัวอย่างเดียวกันของวัสดุตรวจวินิจฉัย

หลอดใส่เชื้อจะอยู่ในตำแหน่งควบคุมอุณหภูมิที่อุณหภูมิ 37 ^องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 วัน เพื่อให้แน่ใจว่าการดูดซึมของวัสดุจะยิ่งดียิ่งขึ้นไปสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ หลังจากผ่านไป 2 วันหลอดจะถูกถ่ายโอนไปยังตำแหน่งแนวตั้งและผนึกแน่นด้วยยางหรือซิลิโคนปลั๊กเพื่อป้องกันการอบแห้งของวัสดุหว่าน

พืชจะฟักที่ 37 ^{เกี่ยวกับ} C เป็นเวลา 10-12 สัปดาห์กับการดูประจำสัปดาห์ สำหรับแต่ละพรีวิวจะมีการบันทึกพารามิเตอร์ต่อไปนี้:

• ระยะเวลาสังเกตเห็นได้จากวันที่มีการเจริญเติบโตของการหว่านเมล็ด
• อัตราการเติบโต (จำนวน CFU);
• การปนเปื้อนของพืชโดยเชื้อจุลินทรีย์หรือเชื้อราที่ไม่พึงประสงค์ (เช่นหลอดจะถูกลบออก);
• ขาดการเจริญเติบโตที่มองเห็นได้ หลอดจะถูกปล่อยให้อยู่ในเทอร์โมสตรั

สารอาหารสารอาหาร

มีการใช้สารอาหารต่างๆในการเพาะปลูก mycobacteria หนาแน่นของเหลวกึ่งของเหลว อย่างไรก็ตามไม่มีสารอาหารที่รู้จักกันดีมีคุณสมบัติที่ช่วยให้การเจริญเติบโตของเซลล์แบคทีเรียทั้งหมด ในการนี้ควรมีการใช้สื่อสารอาหาร 2-3 ชนิดที่มีส่วนประกอบต่างกันเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพ

WHO แนะนำให้สภาพแวดล้อม Levenstein-Jensen เป็นสื่อมาตรฐานสำหรับการแยกเชื้อสาเหตุหลักของวัณโรคและเพื่อหาค่าความไวของยา นี่คือสภาพแวดล้อมที่หนาแน่นของไข่ที่เจริญเติบโตของ mycobacteria จะได้รับในวันที่ 20-25 หลังจากที่มีการเพาะเชื้อแบคทีเรียที่เป็นบวก พืชที่ติดเชื้อแบคทีเรียลบต้องใช้เวลาในการบ่มนานกว่า (10-12 สัปดาห์)

ในประเทศของเรา E.R. เสนอ สภาพแวดล้อม Finn egg Finn-II มันแตกต่างจากที่แทน L-asparagine จะใช้โซเดียมกลูตาเมตซึ่งเรียกวิธีอื่นในการสังเคราะห์กรดอะมิโนของ mycobacteria การเจริญเติบโตปรากฏบนสื่อนี้ค่อนข้างเร็ว ๆ นี้และความถี่ของการจัดสรร mycobacteria สูงกว่า 6-8% ใน Lowenstein-Jensen medium

เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพของการวินิจฉัยทางแบคทีเรียของวัณโรคนอกนูนออกควรมีการดัดแปลง Finn-II media ในสารอาหารที่มีความซับซ้อน เพื่อเร่งการเจริญเติบโตโซเดียม thioglycolate 0.05% ซึ่งจะช่วยลดความเข้มข้นของออกซิเจนจะถูกเพิ่มเข้าไปในสารอาหาร Finn-II อีกด้วย เพื่อป้องกันระบบเอนไซม์ mycobacteria จากผลิตภัณฑ์ที่เป็นพิษในการให้ Peroxidation ไขมันในสารอาหาร Finn-II สารต้านอนุมูลอิสระα-tocopherol acetate จะถูกเพิ่มที่ความเข้มข้น 0.001 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร การทำเมล็ดพันธุ์ของวัสดุตรวจวินิจฉัยจะดำเนินการตามขั้นตอนมาตรฐาน

ในห้องปฏิบัติการป้องกันวัณโรคของรัสเซียการใช้สารอาหารที่มีความหนาแน่นสูงอื่น ๆ เสนอ G.G Mordovian nutrient medium "New" ที่พัฒนาขึ้นโดย V.A. สารอาหาร Anicic A-6 และ A-9 ฯลฯ

เนื่องจากข้อเท็จจริงที่ว่าในกระบวนการของยาเคมีบำบัดความเสียหายให้กับระบบการเผาผลาญของเซลล์ต่างๆของจุลินทรีย์บางประชากรเชื้อสูญเสียความสามารถในการพัฒนาตามปกติในสื่อสารอาหารธรรมดาและต้อง osmotically สมดุล (หรือกึ่งของเหลว) สื่อวัฒนธรรม

การประเมินและการบันทึกผลการเพาะเมล็ดของวัสดุตรวจวินิจฉัย

สายพันธุ์และสายพันธุ์ของเชื้อมัยโคแบคทีเรียบางสายพันธุ์เติบโตช้าการเจริญเติบโตอาจเกิดขึ้นได้ภายใน 90 วัน จำนวนของพืชดังกล่าวมีขนาดเล็ก แต่ทำให้สามารถทนต่อพืชในอุณหภูมิได้ 2.5-3 เดือน

เชื้อโรคที่เป็นอันตรายของเชื้อวัณโรค mycobacterium มักเจริญเติบโตในสภาพแวดล้อมของไข่ที่หนาแน่นในรูปแบบของอาณานิคมรูปตัว R ซึ่งมีหลายขนาดและหลายสายพันธุ์ อาณานิคมแห้งเหี่ยวย่นงาช้างสีเล็กน้อย ในสื่ออื่น ๆ อาณานิคมของวัณโรค mycobacterium อาจจะมีความชุ่มชื้นมากขึ้น หลังจากการรักษาด้วยเคมีบำบัดหรือในระหว่างการรักษาคุณสามารถจัดสรรอาณานิคมที่ราบรื่นพร้อมกับการเจริญเติบโตที่ชุ่มชื้น (S-forms)

เมื่อแยกพืชชุดการศึกษาพิเศษใช้ในการแยกแยะ mycobacterium tuberculosis จากเชื้อวัณโรคที่ไม่ใช่วัณโรคและ saprophytes ที่ทนกรด

การตอบสนองเชิงบวกจะได้รับหลังจากที่ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่จำเป็นในการย้อมสี Tsiol-Nelsen จากกลุ่มอาณานิคมที่โตขึ้น ในกรณีที่มีการเติบโตของเชื้อ mycobacteria ในรอยเปื้อนพบว่ามีก้านสีแดงสดใสที่พบได้โดยลำพังหรือในกลุ่มที่สร้างกลุ่มขึ้นในรูปแบบของความรู้สึกหรือ braids ในวัฒนธรรมหนุ่มที่แยกได้โดยเฉพาะอย่างยิ่งจากการรักษาในระยะยาวของผู้ป่วยที่มียาเคมีบำบัดเชื้อมัยโคแบคทีเรียที่แตกต่างกัน polymorphism แสดงจนกระทั่งการปรากฏตัวของรูปทรงแท่งพร้อมกับรุ่นสั้น coccoid เกือบหรือยาวที่มีลักษณะเส้นใย

อัตราการเติบโตของเชื้อ mycobacteria แสดงด้วยวิธีการดังต่อไปนี้: (+) - 1-20 cfu ในหลอดทดลอง (การขับแบคทีเรียที่ไม่เพียงพอ); (++) - 20-100 CFU ในหลอดทดลอง (การขับแบคทีเรียปานกลาง); (+++) -> 100 CFU ในหลอดทดลอง (การขับแบคทีเรียที่อุดมสมบูรณ์) ในห้องปฏิบัติการการวินิจฉัยโรควัณโรคไม่เพียงพอที่จะตอบว่าเชื้อ mycobacterium ถูกตรวจพบโดยวิธีใดวิธีหนึ่งหรืออีกวิธีหนึ่ง มีความเข้าใจอย่างละเอียดเกี่ยวกับขอบเขตและลักษณะของประชากรเชื้อราองค์ประกอบและสมบัติของเชื้อ mycobacterial เป็นข้อมูลเหล่านี้ที่ช่วยให้เราสามารถตีความสถานะของกระบวนการวางแผนกลยุทธ์และแก้ไขการรักษาได้อย่างทันท่วงที

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาเพื่อเร่งการเจริญเติบโตของเชื้อ mycobacteria สารอาหารในอาหารเลี้ยงเชื้อบนพื้นฐานของวุ้นด้วยสารเติมแต่งการเจริญเติบโตต่างๆและการใช้ส่วนผสมของก๊าซพิเศษ เพื่อให้ได้เชื้อ Mycobacteria บนสื่อเหล่านี้มีการสร้างบรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์สูง (4-7%) ในระหว่างการเพาะปลูก เครื่องอัดCO ₂พิเศษใช้เพื่อการนี้ อย่างไรก็ตามระบบที่พัฒนาโดยอัตโนมัติส่วนใหญ่สำหรับการเพาะปลูก mycobacteria: MGIT-BACTEC-960 และ MB / Bact

ระบบหนึ่งเช่น - ระบบ MGIT (หลอดการเจริญเติบโตของเชื้อมัยโคแบคทีเรียบ่งชี้) ซึ่งหมายถึงการพัฒนาของเทคโนโลยีชั้นสูงและมีจุดมุ่งหมายเพื่อการวินิจฉัยแบคทีเรียอย่างรวดเร็วของวัณโรคและเชื้อไวต่อยาเสพติดบรรทัดแรกและบางยาเสพติดบรรทัดที่สอง MGIT มุ่งเน้นการใช้เป็นส่วนหนึ่งของอุปกรณ์ VASTES-960 จุลินทรีย์ถูกเพาะเลี้ยงในหลอดพิเศษด้วยสารอาหารเหลวที่อยู่บนพื้นฐานของ Middlebrook-7H9 เพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโตของเชื้อ mycobacteria และยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ภายนอกการใช้สารเสริม MGIT Growth และส่วนผสมของยาต้านเชื้อแบคทีเรีย PANTA

การเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์จะถูกบันทึกด้วยแสง มันขึ้นอยู่กับการเรืองแสงซึ่งเกิดขึ้นเมื่อมีการใช้ออกซิเจนโดยเชื้อ mycobacteria ในระหว่างการเจริญเติบโต สีย้อมสีที่ขึ้นกับออกซิเจนจะอยู่ที่ด้านล่างของท่อทดสอบพิเศษและปกคลุมด้วยชั้นของซิลิโคน การสืบพันธุ์เชื้อมัยโคแบคทีเรียที่นำไปสู่การลดลงของปริมาณออกซิเจนในหลอดและลดความเข้มข้นที่เป็นสาเหตุของการเพิ่มขึ้นในการเรืองแสงซึ่งจะปรากฏอยู่ภายใต้การฉายรังสีจากหลอดแสงยูวีและ photosensor ลงทะเบียนโดยอัตโนมัติในตัวเครื่อง VASTES-960 ความเข้มของการเรืองแสงจะถูกบันทึกไว้ในหน่วยของการเจริญเติบโต (GU หน่วยการเจริญเติบโต) ข้อมูลการเจริญเติบโตจะถูกบันทึกลงในคอมพิวเตอร์ซึ่งสามารถบันทึกข้อมูลเหล่านี้ได้โดยอัตโนมัติ วิเคราะห์คอมพิวเตอร์ของเส้นโค้งการเจริญเติบโตสามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับสถานะของความหลากหลายของสระว่ายน้ำเชื้อรวมทั้ง nontubercular และยังช่วยในการประเมินคุณสมบัติการเจริญเติบโตของเชื้อมัยโคแบคทีเรีย

จากการแนะนำระบบดังกล่าวเวลาในการเจริญเติบโตของเชื้อ mycobacteria ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยเฉลี่ย 11 วันสำหรับ VASTES-960 และ 19 วันในสูตร MB / Bact เทียบกับ 33 วันในอาหารที่ให้ความหนาแน่นมาตรฐาน ควรสังเกตว่าระบบเหล่านี้ต้องการบุคลากรที่มีคุณภาพสูง การหว่านเมล็ดของวัสดุบนสื่อเหลวนั้นมาพร้อมกับการหว่านเมล็ดในอาหาร Levenstein-Jensen ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการสำรองข้อมูลในกรณีที่เชื้อวัณโรค mycobacterium ไม่ก่อให้เกิดสื่ออื่น ๆ

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

การกำหนดความไวของยาเสพติด mycobacteria

การกำหนดสเปกตรัมและระดับความไวของเชื้อ mycobacteria ต่อยาต้านวัณโรคมีความสำคัญทางคลินิกเช่นเดียวกับการประเมินระบาดวิทยาของการแพร่ระบาดของวัณโรคที่มีความต้านทานต่อยา นอกจากนี้การตรวจสอบความต้านทานยาเสพติดทำให้สามารถประเมินประสิทธิภาพของโปรแกรมวัณโรคโดยรวมซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ที่สำคัญในการปฏิบัติงานของทุกองค์ประกอบของกิจกรรมต้านวัณโรค

ความหลากหลายและความไวของยา:

• ก่อนที่จะเริ่มการรักษาครั้งสำหรับการกำหนดกลยุทธ์และกลยุทธ์ในการรักษา:
• เมื่อแยกจากเชื้อโรคที่เป็นโรคจากวัสดุต่างๆ (เสมหะ, ของเหลว BAL, ปัสสาวะ, exudates, สุรา, ฯลฯ ) ทุกสายพันธุ์ที่แยกได้รับการตรวจสอบ:
• ในตอนท้ายของระยะเข้มข้นของการรักษาในกรณีที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงทางคลินิกและรังสี:
• ถ้าจำเป็นต้องเปลี่ยนสูตรการรักษาในกรณีต่อไปนี้:
  • ไม่มีเสมหะ
  • แยกใหม่ของวัฒนธรรมหลังจากเสมหะ smear เชิงลบ;
  • การเพิ่มขึ้นของจำนวน CMB ในก้านหลังการลดลงครั้งแรก เป็นที่ทราบกันดีว่าสายพันธุ์ของวัณโรค mycobacterium ซึ่งแตกต่างกันในแง่ของความไวของยาถูกแยกออกจากวัสดุจากผู้ป่วยวัณโรค ความไวของสายพันธุ์ต่อยาต้านวัณโรคอาจแตกต่างกันในช่วงของยาระดับการศึกษาความถี่และอัตราการเกิดความต้านทาน

ระดับของความต้านทานต่อยาของวัณโรค mycobacterium ถูกกำหนดตามเกณฑ์ที่กำหนดซึ่งมุ่งเน้นไปที่ความสำคัญทางคลินิกของความต้านทานและขึ้นอยู่กับฤทธิ์ต้านวัณโรคของยาเภสัชจลนศาสตร์ความเข้มข้นในการโฟกัสของแผล ปริมาณการรักษาสูงสุดและอื่น ๆ

การกำหนดความไวของยา mycobacteria ปัจจุบันดำเนินการโดยวิธีทางจุลชีววิทยา:

• ความเข้มข้นสัมบูรณ์ (วิธีการเจือจางสารสื่ออาหารที่หนาแน่นหรือของเหลว),
• สัดส่วน
• ค่าสัมประสิทธิ์ของความต้านทาน

มักมีความต้านทานเป็นที่ประจักษ์ในรูปแบบของการเจริญเติบโตสังเกตเห็นของอาณานิคมของ mycobacterium tuberculosis แต่มีวิธีการที่ทำให้เกิดการเจริญเติบโตในระยะแรกของการแบ่งเซลล์ของ mycobacteria ในรูปแบบของปฏิกิริยาสี วิธีการเหล่านี้จะทำให้ระยะเวลาการทดสอบสั้นลงตั้งแต่ 3-4 ถึง 2 สัปดาห์

ในฐานะที่เป็นปึกแผ่นในรัสเซียได้รับการขยายแนะนำจากคณะกรรมการองค์การอนามัยวิธีการรักษาด้วยเคมีบำบัดความเข้มข้นแน่นอนซึ่งอยู่ห่างจากจุดระเบียบวิธีการในมุมมองของเป็นที่ง่ายที่สุด แต่ต้องใช้ความแม่นยำสูงและมาตรฐานของขั้นตอนการตรวจทางห้องปฏิบัติการ การทดสอบความไวของยาประกอบด้วยชุดของหลอดทดลองที่มีสารอาหารที่ดัดแปลงมาจากยาต้านวัณโรค ชุดประกอบด้วย 2-3 หลอดที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของแต่ละคนของยาเสพติดที่ใช้หลอดหนึ่งในการควบคุมยาเสพติดที่มีต่อสิ่งแวดล้อมและเป็นหนึ่งในหลอดที่มี 1,000 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรของโซเดียมไพศาลี tsilovokislogo หรือ 500 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร paranitrobenzoynoy nontubercular กรดในการตรวจสอบการเจริญเติบโตของเชื้อมัยโคแบคทีเรีย

เพื่อเตรียมชุดของสื่อกับการเตรียมการปรับเปลี่ยนสื่อ Levenstein - Jensen (ไม่มีแป้ง) จะใช้ซึ่งจะเทลงในขวด ในแต่ละขวดจะมีการเพิ่มปริมาตรเฉพาะของการเจือจางที่เหมาะสมในการเตรียมสารต้านวัณโรค เนื้อหาของขวดจะถูกผสมอย่างทั่วถึงเทลงในหลอดและพับในตำแหน่งเอียงเป็นเวลา 40 นาทีที่อุณหภูมิ 85 องศาเซลเซียส ขอแนะนำให้ขดลวดกลางในเครื่อง rewinder ไฟฟ้าด้วยการควบคุมอุณหภูมิโดยอัตโนมัติ วันพุธที่มียาต้านวัณโรค

ชุดที่ 1 สามารถเก็บรักษาไว้ในตู้เย็นได้ที่อุณหภูมิ 2-4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 เดือนโดยเตรียมชุดที่ 2 แถวไม่เกิน 2 สัปดาห์ การเก็บรักษาสื่อที่มีการเตรียมที่อุณหภูมิห้องเป็นที่ยอมรับไม่ได้ เมื่อเตรียมสารละลายของยาต้านวัณโรคกิจกรรมของพวกเขาจะถูกนำมาพิจารณาโดยการคำนวณความเข้มข้นที่ปรับตามน้ำหนักโมเลกุลของส่วนที่ไม่สำคัญของการเตรียมความบริสุทธิ์ ฯลฯ เพื่อตรวจสอบความไวของยาเสพติดใช้สารเคมีบริสุทธิ์เท่านั้น

หลักการของวิธีนี้คือการกำหนดความเข้มข้นของยาต้านวัณโรคที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของประชากรส่วนใหญ่ของเชื้อ mycobacterial หากทำอย่างถูกต้องวิธีนี้มีความน่าเชื่อถือดี

ก่อนการทดสอบจำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าวัฒนธรรมที่แยกได้ของเชื้อวัณโรคจากเชื้อแบคทีเรียไม่ได้มีเชื้อจุลินทรีย์ภายนอก จากวัฒนธรรมของเชื้อมัยโคแบคทีเรียใน 0.9% สารละลายโซเดียมคลอไรด์ที่เตรียมระงับเป็นเนื้อเดียวกันที่มี 500 ล้านร่างกายของจุลินทรีย์ใน 1 มิลลิลิตร (ขุ่นแสงมาตรฐาน 5 หน่วย) สารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.9% เจือจางด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ (1:10) และใส่สารละลาย 0.2 มิลลิลิตรลงในหลอดทดลองแต่ละชุด หลอดเชื้อถูกวางไว้ในตู้อบที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและจัดขึ้นในตำแหน่งแนวนอน 2-3 วันกับพื้นผิวลาดของกลางที่ถูกเชื้ออย่างเท่าเทียมกันกับการระงับของเชื้อวัณโรค จากนั้นหลอดจะถูกถ่ายโอนไปยังตำแหน่งแนวตั้งและบ่มเป็นเวลา 3-4 สัปดาห์ ผลลัพธ์จะถูกบันทึกหลังจาก 3-4 สัปดาห์

เนื่องจากระยะเวลาในการขับถ่ายของสารขับถ่ายออกจากวัสดุทางคลินิกในสารอาหารเป็นเวลาอย่างน้อย 1-1.5 เดือนผลของการประเมินความไวของยาโดยวิธีนี้จะได้รับไม่ช้ากว่า 2-2.5 เดือนหลังจากการหว่านเมล็ด นี่คือหนึ่งในข้อบกพร่องหลักของวิธีการ

ตีความผลของการกำหนดความไวของยา mycobacteria บนพื้นฐานของเกณฑ์บางอย่าง ในสื่อที่หนาแน่นวัฒนธรรมถือว่ามีความไวต่อความเข้มข้นของยาที่มีอยู่ในตัวกลางถ้าจำนวนโคโลนีของเชื้อ Mycobacteria ที่ปลูกในหลอดนี้กับยาไม่เกิน 20 โดยมีการเจริญเติบโตมากในหลอดทดลองโดยไม่มียาเสพติด เฉพาะในที่ที่มีมากกว่า 20 โคโลนี่เป็นวัฒนธรรมที่ถือว่าทนต่อความเข้มข้นนี้ ในทางปฏิบัติเมื่อได้รับผลการเจริญเติบโตในหลอดทดสอบใกล้เคียงกับ 20 cfu จำเป็นต้องแจ้งให้หน่วยงานทางคลินิกว่าความไวหรือความต้านทานในกรณีนี้เป็นเส้นเขตแดนเนื่องจากบางครั้งก็สามารถอธิบายการเปลี่ยนแปลงทางฟัซซี่ของตัวบ่งชี้ทางคลินิกได้

สำหรับยาเสพติดชนิดต่างๆจะมีการสร้างความเข้มข้นที่แน่นอนซึ่งจะมีการทำสำเนาสัดส่วนที่สำคัญของประชากรเชื้อ mycobacterial ความเข้มข้นเหล่านี้เรียกว่า "สำคัญ" เป็นเกณฑ์ของความมั่นคงการเจริญเติบโตของประชากรของ mycobacteria บนอาหารที่มีสารอาหารที่มีการเตรียมที่ความเข้มข้นที่สำคัญจะใช้

ในการปฏิบัติวัณโรคในประเทศในการกำหนดความต้านทานยาพวกเขาไม่ได้ จำกัด เพียงการกำหนดความเข้มข้นที่สำคัญเท่านั้น นี่เป็นเพราะความเป็นจริง ที่ระดับความละเอียดของการขยายการดื้อยาช่วยให้แพทย์ที่จะวางตำแหน่งกลยุทธ์เคมีบำบัดโดยใช้ความรู้ในการดำเนินการออกฤทธิ์ของการผสมยาเสพติดถูกต้องมากขึ้น crisscross คาดว่าความต้านทานหรือจะใช้ยาต้านวัณโรคมีประสิทธิภาพมากขึ้นในกลุ่มที่ใช้ยาเสพติด

วิธีการวัดสมาธิแบบสัมบูรณ์เป็นวิธีที่ง่ายที่สุด แต่ก็ยังมีความไวต่อข้อผิดพลาดที่เกิดขึ้นเมื่อทำ น่าเชื่อถือมากขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการกำหนดความไวต่อยาเสพติดในบรรทัดที่สองและภายนอกที่พบบ่อยของรัสเซียเป็นวิธีการของสัดส่วน จะคำนึงถึงข้อบกพร่องของวิธีการของความเข้มข้นสัมบูรณ์ แต่ในการดำเนินการจะลำบากมากขึ้น

วิธีนี้มีความคล้ายคลึงกับวิธีการวัดความเข้มข้นสัมบูรณ์ การจัดทำหลอดทดสอบด้วยยาจะดำเนินการในลักษณะเดียวกัน เช่นเดียวกับวิธีการวัดความเข้มข้นสัมบูรณ์ อย่างไรก็ตามปริมาณเชื้อวัณโรคของเชื้อวัณโรคจะลดลง 10 เท่า ซึ่งจะช่วยลดความถี่ของความต้านทานที่เกิดขึ้นเองของเชื้อวัณโรคที่มีต่อ mycobacterium tuberculosis บางชนิดเช่น Etambutol, protionamide, capreomycin ในการควบคุมให้ใช้หลอด 2 หรือ 3 ที่มีปริมาณเมล็ดเท่ากับในหลอดทดลองและต่อด้วยการเจือจางครั้งที่ 10 และ 100 ครั้ง เกณฑ์การรักษาเสถียรภาพคือสัดส่วนของการเจริญเติบโตที่สังเกตเห็นได้ของ mycobacterium tuberculosis สำหรับยาเสพติดของชุดที่ 1 เกณฑ์ความมั่นคงคือส่วนที่เกินจากการเติบโตของ 1% ของประชากรที่เริ่มต้นสำหรับยาในแถวที่สอง - เพิ่มขึ้น 1 หรือมากกว่า 10% ของค่าเริ่มต้นขึ้นอยู่กับความเข้มข้นที่สำคัญที่เลือก

ในปี 1997 คณะทำงานขององค์การอนามัยโลกและสหภาพนานาชาติเพื่อการบัตรประจำตัวของผู้ป่วยวัณโรคที่ดีดื้อยาวัณโรคได้ทำการปรับเปลี่ยนเกณฑ์เหล่านี้นำเสนอการพิจารณาเชื้อมัยโคแบคทีเรียทนซึ่งเติบโตในสื่อไข่แข็ง Lowenstein เซ่นที่ความเข้มข้นต่อไปนี้:

• dihydrostreptomycin - 4 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร
• isoniazid 0.2 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร:
• rifampicin 40 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร:
• Ethambutol - 2 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร

ในปีพ. ศ. 2544 ได้มีการเสนอความเข้มข้นที่สำคัญสำหรับยาสายสอง (ต่อไปนี้เป็นสัดส่วนสำคัญที่ 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamide - 40 mcg / ml;
• kanamycin - 30 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร
• viomycin - 30 mcg / ml;
• cycloserine 40 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร
• กรด aminosalicylic - 0.5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร

ผลการเจริญเติบโตมีการประเมินหลังจาก 4 สัปดาห์เป็นเบื้องต้นและหลังจาก 6 สัปดาห์ของการเพาะปลูก - เป็นครั้งสุดท้าย

เพื่อประเมินความไวของยาต่อ pyrazinamide ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในเคมีบำบัดสมัยใหม่สำหรับวัณโรคความเข้มข้นที่สำคัญคือ 200 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร อย่างไรก็ตามยังคงไม่มีวิธีการที่ยอมรับโดยทั่วไปในการกำหนดความต้านทานต่อยานี้ในสื่อสารอาหารที่เป็นของแข็งเพราะฤทธิ์ต้านแบคทีเรียของมันจะได้มีเฉพาะในสื่อที่เป็นกรด (pH <6) ซึ่งเป็นเทคนิคที่ยากที่จะรักษา นอกจากนี้วัฒนธรรมทางคลินิกหลายอย่างของเชื้อวัณโรค mycobacteria อย่างไม่เต็มใจเติบโตในสภาพแวดล้อมไข่ที่มีสภาพแวดล้อมที่เป็นกรด

เพื่อประเมินคุณภาพของผลการตรวจสอบความไวของยาเสพติด mycobacteria ขอแนะนำให้ตรวจสอบแต่ละชุดใหม่ของอาหาร Levenstein-Jensen ด้วยการกำหนดความไวของสายพันธุ์พิพิธภัณฑ์มาตรฐาน H37Rv แบบขนาน นอกจากนี้ยังมีเกณฑ์ทางจุลชีววิทยาบางอย่างที่ต้องได้รับการดูแลเพื่อให้เทคนิคนี้สามารถนำมาใช้ในการตีความผลการทำซ้ำได้ดีและถูกต้อง เหล่านี้รวมถึงความเป็นไปได้ในการเพาะเลี้ยงเชื้อวัณโรค mycobacterium กฎสำหรับการได้รับการระงับและการระงับเนื้อเดียวกันกฎสำหรับการเลือกวัฒนธรรมของ mycobacterium tuberculosis ความเป็นตัวแทนของมวลแบคทีเรียที่เลือก ความน่าเชื่อถือของการกำหนดความต้านทานยาลดลงเมื่อปล่อยแบคทีเรียที่หายากมาก

เมื่อเร็ว ๆ นี้วิธีการในการกำหนดความไวของยาโดยใช้ระบบอัตโนมัติถือว่าเป็นไปได้ ที่สมบูรณ์แบบที่สุดในบริเวณนี้คือการพัฒนาบนพื้นฐานของ VASTES MGIT-960 ในกรณีนี้ความไวของยาเสพติดของเชื้อวัณโรค mycobacterium จะพิจารณาจากวิธีการปรับเปลี่ยนสัดส่วน ในกระบวนการของการกำหนดอัตราการเติบโตของวัณโรค mycobacterium ในหลอดควบคุมและในหลอดทดลองกับยาเสพติดจะถูกเปรียบเทียบ เพื่อตรวจสอบความไวแสงได้ streptomycin, isoniazid, แนวปะการัง pitsinu และ ethambutol จะใช้ในการเพิ่มคุณค่าสารเติมแต่งและยาปฏิชีวนะรวมอยู่ในชุดชุดฝ่าบาท เพื่อหาค่าความไวต่อ pyrazinamide ให้ใช้ชุด PZA ในหลักสูตรของการระงับการทดสอบเชื้อวัณโรคเชื้อหลอดทดสอบกับยาเสพติดเช่นเดียวกับหลอดควบคุมด้วยการระงับสร้าง 100 ครั้งสำหรับยาเสพติดทั้งหมดยกเว้น pyrazinamide ประเด็นระงับคือการลดสัดส่วนของ 10 ครั้ง เกณฑ์ความมั่นคง Mycobacteria การเจริญเติบโตของดัชนีมูลค่า 100 GU เมื่อเจริญเติบโตในหลอดควบคุม 400 GU (ซม. "วัฒนธรรมของวิธีการแยกเชื้อมัยโคแบคทีเรีย") การบัญชีและการตีความผลการทดสอบจะดำเนินการโดยอัตโนมัติและถูกตั้งค่าโดยการนำเข้าหรือโปรแกรมที่เลือก

ในฐานะที่เป็นความเข้มข้นที่สำคัญความเข้มข้นขั้นสุดท้ายจะถูกนำมาใช้ในหลอดทดสอบที่มีสารอาหารเหลว ปัจจุบันได้มีการพัฒนาความเข้มข้นที่สำคัญสำหรับทั้งยาสาย 1 และบรรทัดที่สอง ควรสังเกตว่าความไวของวัณโรค mycobacteria ต่อ cycloserine และกรด aminosalicylic จะพิจารณาเฉพาะในอาหารที่มีไข่

(โดยใช้สารอาหารที่หนาแน่น) และใช้การเจริญเติบโตหลักของ mycobacterium ในท่อ MGIT การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า ตัวเลือกหลังอย่างมีนัยสำคัญจะช่วยลดเวลาสำหรับการเพาะเลี้ยงที่ช่วยให้คุณที่จะได้รับผลเต็มรูปแบบของวัฒนธรรมของเชื้อวัณโรค (รวมถึงข้อมูลเกี่ยวกับยาไว) หลังจาก 3 สัปดาห์นับจากวันของคอลเลกชันของวัสดุในขณะที่วิธีการแบบดั้งเดิมก็เป็นไปได้ที่จะได้รับเพียง 3 เดือน ในเวลาที่ผลที่ได้รับเมื่อผู้ป่วยอยู่ในช่วงการรักษาอย่างเข้มข้นสามารถชดเชยค่าใช้จ่ายในการวิจัยที่ค่อนข้างสูง

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

ความแตกต่างของ mycobacteria

คำนึงถึงว่าสารอาหารที่ใช้ไม่ได้เลือกอย่างเคร่งครัด ความแตกต่างที่ตามมาของ mycobacteria ที่แยกได้รับการยอมรับว่าเป็นข้อบังคับ ความจำเป็นในการสร้างความแตกต่างของเชื้อมัยโคแบคทีเรียเป็นเพราะจำนวนของคุณสมบัติของกระบวนการทางพยาธิสภาพที่เกิดจากสกุล: หลักสูตรที่แตกต่างกันและผลของวัณโรคและ mycobacteriosis การปรากฏตัวของการดื้อยาธรรมชาติบางยาต้านวัณโรค

เป็นที่ยอมรับว่าบัตรประจำตัวหลักของเชื้อวัณโรคที่ซับซ้อนเอ็ม nontubercular จากเชื้อมัยโคแบคทีเรียจะดำเนินการโดยลักษณะดังต่อไปนี้: อัตราการเจริญเติบโตในสื่อที่เป็นของแข็งสารอาหารผิวคล้ำอาณานิคมสัณฐานการปรากฏตัวของความต้านทานต่อกรดและการเจริญเติบโตที่เหมาะสมอุณหภูมิ

แต่น่าเสียดายที่ไม่มีวิธีการตรวจทางห้องปฏิบัติการเดียวที่จะเชื่อถือได้แยกความแตกต่างเชื้อวัณโรคเชื้อมัยโคแบคทีเรียที่ซับซ้อนอื่น ๆ จากแบคทีเรียกรดอย่างรวดเร็ว แต่รวมกันของคุณสมบัติที่อธิบายข้างต้นกับผลที่ได้รับด้านล่างของจำนวนของการทดสอบทางชีวเคมีที่ช่วยให้บัตรประจำตัวของเชื้อวัณโรคที่ซับซ้อนที่มีเอ็มมีแนวโน้มที่จะ 95%

สำหรับความแตกต่างของเชื้อที่ซับซ้อนวัณโรค (วัณโรค, M. Bovis เมตร bovisBCG เอ็ม africanum เอ็ม microti, M. Canettii และอื่น ๆ ) จากเชื้อมัยโคแบคทีเรียเจริญเติบโตช้าใช้ nontubercular การทดสอบทางชีวเคมีพื้นฐานที่ตรวจสอบสถานะของอาการดังต่อไปนี้:

• ความสามารถในการผลิตกรดนิโคตินิก (niacin test):
• กิจกรรม reductase ของไนเตรต
• thermalable catalase;
• การเจริญเติบโตในอาหารที่มี sodium salicylate (1 มก. / มล.)

ในฐานะที่เป็นการทดสอบเพิ่มเติมการเจริญเติบโตบนอาหารที่มี 500 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรของกรด paranitrobenzoic หรือ 5% โซเดียมคลอไรด์ยังสามารถใช้

ห้องปฏิบัติการด้านแบคทีเรียหลายแห่งระบุเชื้อจุลินทรีย์เหล่านี้เฉพาะในระดับที่ซับซ้อนซึ่งเป็นผลมาจากขีดความสามารถของห้องปฏิบัติการและความสามารถเชิงเทคนิคของผู้เชี่ยวชาญเฉพาะด้าน

ในกรณีส่วนใหญ่ แต่ในทางปฏิบัติสำหรับความแตกต่างของเชื้อวัณโรคและเอ็ม Bovis คือการทดสอบต่อไปนี้เพียงพอ: ไนอาซิน, การปรากฏตัวของไนเตรต, การลงทะเบียนการปรากฏตัวและการเจริญเติบโต pirazinamidazy ในระดับปานกลางมี 2 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร hydrazide ของกรด thiophene-2-คาร์บอกซิ มันถูกนำมาพิจารณาว่า mycobacteria ของ M. Tuberculosis complex มีลักษณะตามตัวอักษรต่อไปนี้:

• การเจริญเติบโตช้า (มากกว่า 3 สัปดาห์);
• อุณหภูมิการเจริญเติบโตในช่วง 35-37 ^o C;
• การขาดสี (งาช้าง);
• สีที่เป็นกรดอย่างรวดเร็ว;
• การทดสอบไนอาซินที่เป็นบวก
• การทดสอบการลดระดับไนเตรทเป็นบวก
• ไม่มีตัวเร่งปฏิกิริยา (68 ^องศาเซลเซียส)
• การขาดการเจริญเติบโตในสื่อ Levenstein-Jensen ประกอบด้วย:
  • 1000 salicylate sodium salicylate 1000 ไมโครกรัม /
  • 500 μg / ml ของกรด paranitrobenzoic,
  • โซเดียมคลอไรด์ 5%:
• การเจริญเติบโตในที่ที่มีกรดโทโคฟีน -2-ester-2-carboxylic ที่ 1-5 μg / ml

ความเกี่ยวข้องของความแตกต่างของ mycobacteria ที่แยกได้จะเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเพิ่มความถี่ในการบันทึกข้อมูลกรณีที่ติดเชื้อเอชไอวี / เอดส์ที่เกี่ยวข้องกับวัณโรคหรือ mycobacteriosis ปัจจุบันไม่มีความแน่นอนแน่นอนว่าความพร้อมของห้องปฏิบัติการระดับภูมิภาคในทางปฏิบัติเพื่อให้สามารถทำงานได้อย่างถูกต้อง

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

การวินิจฉัยโรควัณโรคด้วยภูมิคุ้มกัน

มีหลายปรากฏการณ์สากลยาเสพติดและการทดสอบทางภูมิคุ้มกันที่ถูกค้นพบได้อย่างถูกต้องด้วยวัณโรคหรือในรูปแบบของการตอบสนองต่อระบบภูมิคุ้มกันต่อ mycobacteria เหล่านี้รวมถึง BCG วัณโรค, ปรากฏการณ์ดังกล่าวเป็นผิวหนัง DTH (ที่ tuberculin - Pirquet และ Mantoux ปฏิกิริยา) ปฏิกิริยาไว tuberculin สัตว์ใต้ผิวหนัง (Koch ปรากฏการณ์) หนึ่งในแอนติบอดีแรกในโรคติดเชื้อได้รับการตรวจพบในวัณโรค ความเข้าใจในกลไกการต่อต้านภูมิคุ้มกันและการควบคุมทางพันธุกรรมของพวกเขาลึกซึ้งยิ่งขึ้นความกว้างอาจใช้วิธีการทางภูมิคุ้มกันและยาที่มีผลต่อภูมิคุ้มกันในการแก้ปัญหาในทางปฏิบัติของ phthisiology

ปัญหาการปฏิบัติที่สำคัญและยากที่สุดในปัจจุบันถือเป็นการตรวจหาวัณโรคในกระบวนการคัดกรองมวลของประชากร อย่างไรก็ตามแม้จะมีรายงานจำนวนมากเกี่ยวกับ "ความสำเร็จ" (ในวัสดุที่ จำกัด ) ไม่มีวิธีการทางภูมิคุ้มกันที่เหมาะสม (สามารถทำซ้ำได้ใน "แขนใด ๆ ") และยาที่เหมาะสมกับจุดประสงค์นี้

วิธีการทางภูมิคุ้มกันในการศึกษาทางซีรั่มโดยเฉพาะอย่างยิ่ง (การกำหนดแอนติเจนแอนติบอดี) และการทดสอบการกระตุ้น tuberculin มีการใช้กันอย่างกว้างขวางในการปฏิบัติการทางคลินิก

ในส่วนแรกของการศึกษาเกี่ยวกับภูมิคุ้มกันในการวินิจฉัยที่แตกต่างกันมีวิธีการทางซีรั่มคือการกำหนดแอนติเจนและแอนติบอดีในสภาพแวดล้อมที่แตกต่างกันของร่างกาย

ความเฉพาะเจาะจงของแอนติบอดีต่อวัณโรค mycobacteria ขึ้นอยู่กับแอนติเจนที่ใช้ในการวิเคราะห์ด้วยภูมิคุ้มกัน มีการนำเสนอแอนติเจนจำนวนมากซึ่งส่วนใหญ่เป็นวัณโรค PPD:

• PAP และการเตรียมอาหารที่ซับซ้อนอื่น ๆ จากของเหลวที่เลี้ยงในอาหาร
• การสลายตัวของอัลตราโซนิค
• สารสกัดไตรตันและการเตรียมเซลล์ที่ซับซ้อนของผนังเซลล์
• 5 แอนติเจน (แดเนียล);
• 60 แอนติเจน (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• สายปัจจัย (trehalose-6,6-di-mycollate);
• phenolic และ glycolipids อื่น ๆ
• lipopolysaccharide;
• แอนติเจนที่มีผลต่อ fibronectin;
• โปรตีน (มัก recombinant); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA ฯลฯ

จากผลการวิจัยของนักวิทยาศาสตร์ชาวรัสเซียและนักวิทยาศาสตร์ชาวต่างชาติหลายปีพบว่ารูปแบบหลักของการสร้างแอนติบอดีและประสิทธิภาพของการวินิจฉัยโรควัณโรคในซีรัม ได้แก่ แอนติเจนที่ซับซ้อนมากขึ้นความไวและความจำเพาะที่ต่ำกว่าของการทดสอบ ความจำเพาะในต่างประเทศแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับจำนวนประชากรของเอ็มติดเชื้อวัณโรคและเชื้อมัยโคแบคทีเรีย nontubercular จากการแบกฉีดวัคซีนบีซีจีและอื่น ๆ . ในเด็กเนื้อหาข้อมูลของ serodiagnosis ต่ำกว่าในผู้ใหญ่ ในวัณโรคปฐมภูมิ (บ่อยกว่าเด็ก) ความหมายของ IgM เป็นข้อมูลเพิ่มเติม กับ IgG รอง ในผู้ป่วยที่ติดเชื้อเอชไอวีค่าความรู้เกี่ยวกับ serodiagnosis ในการหาแอนติบอดีจะลดลง ความมุ่งมั่นในด้านประสิทธิภาพของแอนติบอดีขึ้นอยู่กับจำนวนของ "ลักษณะทางคลินิก" นี้: กิจกรรมกระบวนการ (มีหรือไม่มีของ "แยก" เชื้อมัยโคแบคทีเรียปรากฏตัวผุของฟันผุระดับของการแทรกซึม) ความชุกของกระบวนการระยะเวลาของการไหลของมัน

ความไวของวิธีการตรวจ ELISA ประมาณ 70% ประสิทธิภาพที่ไม่เพียงพอของการศึกษานี้เป็นเพราะความจำเพาะต่ำ ก่อนหน้านี้ได้พิจารณาความเป็นไปได้ในการใช้การตรวจคัดกรองทางซีรั่มในกลุ่มที่มีความเสี่ยงสูงโดยเฉพาะในคนที่มีการเปลี่ยนแปลงวัณโรคในปอด

เพื่อเพิ่มความเฉพาะเจาะจงของ ELISA การค้นหาแอนติเจนเฉพาะเจาะจงมากขึ้นรวมทั้งสิ่งที่ได้จากวิศวกรรมทางพันธุกรรม: ESAT-6 เป็นต้น (ดูด้านบน) ต่อไป การใช้แอนติเจนเฉพาะเจาะจงอย่างเคร่งครัด (38 kDa, ESAT) จะเพิ่มความจำเพาะ แต่จะช่วยลดความไวของการวิเคราะห์ได้อย่างมาก พร้อมกับที่ปรึกษาทางการเงิน (ระบบทดสอบการทดลองในห้องปฏิบัติการ. เช่นการ Pathozyme ELISA ชุด) นอกจากนี้ยังมีชุดที่มีการกรอง immunochromatographic ด้านข้าง (Mycodot) เช่นเดียวกับการทดสอบอื่น ๆ ที่คล้ายกัน (dot-การวิเคราะห์เกี่ยวกับเมมเบรน) มีการประเมินภาพของผลการทดสอบ ในระหว่างการทดสอบเหล่านี้การวิเคราะห์จะดำเนินการเป็นเวลา 10-30 นาที; พวกเขาไม่จำเป็นต้องมีอุปกรณ์พิเศษพวกเขาต้องมีการประเมินภาพผลซึ่งเกี่ยวข้องกับเรื่องส่วนตัว วิธีการเหล่านี้มีความไวและความจำเพาะเหมือนกัน (70% และ 90-93% ตามลำดับ) เป็น ELISA แบบดั้งเดิม

การใช้วิธีการวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันมีคุณค่าที่ชัดเจนโดยพิจารณาจากความซับซ้อนของวิธีการที่ใช้ในการวินิจฉัยวัณโรคที่แตกต่างกันโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการวินิจฉัยรูปแบบของท่อปอดบวม วิธี ELISA มีประสิทธิภาพมากที่สุดคือในการวินิจฉัยโรคเยื่อหุ้มสมองอักเสบวัณโรคในการศึกษาน้ำไขสันหลังอักเสบ ในกรณีนี้ความไวของการวิเคราะห์คือ 80-85% และความจำเพาะคือ 97-98% มีข้อมูลเกี่ยวกับประสิทธิภาพของการตรวจหาแอนติบอดีต่อวัณโรค mycobacteria ในของเหลวที่ฉีกขาดในการวินิจฉัยโรคเยื่อหุ้มปอดอักเสบที่เป็นวัณโรค (tuberculous uveitis)

การเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ interferon gamma ในหลอดทดลอง

Gamma interferon (IFN-γ) เป็นตัวรับการป้องกันภูมิคุ้มกันเฉพาะที่เกิดขึ้นจากการกระตุ้นระบบเอนไซม์ macrophage การเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ IFN-γด้วย T-lymphocytes ที่ไวทำให้เกิดอันตรกิริยากับแอนติเจนของ mycobacteria

เป็นแอนติเจนที่ใช้เป็น tuberculin PPD และแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจงได้โดยพันธุวิศวกรรมในแอนติเจนโดยเฉพาะอย่างยิ่ง ESAT-6 (ต้นแอนติเจนหลั่งมีน้ำหนักโมเลกุล 6 กิโลดาลตัน) และ CFP-10 (วัฒนธรรมกรองโปรตีน 10 กิโลดาลตัน) ในเซลล์ของวัคซีน BCG และ mycobacteria อื่น ๆ ไม่มีไวรัสพันธุวิศวกรรมหรือแอนติเจนชนิดรีคอมบิแนนส์ เมื่อใช้ tuberculin ผลลัพธ์ของการทดสอบการเหนี่ยวนำ IFN-γจะเปรียบเทียบได้กับผลลัพธ์ของการทดสอบผิว tuberculin (ความสัมพันธ์โดยตรง) เมื่อใช้แอนติเจนที่ดัดแปลงพันธุกรรมผลการทดสอบจะเจาะจงมากขึ้นและไม่ขึ้นอยู่กับการฉีดวัคซีนบีซีจีก่อนหน้านี้ เมื่อทดสอบผู้ที่ได้รับวัคซีนที่ไม่ได้สัมผัสกับเชื้อวัณโรคความจำเพาะของการทดสอบคือ 99% ความไวของการทดสอบในผู้ป่วยวัณโรคมีความแตกต่างกัน 81-89%

การทดสอบและเครื่องมือวินิจฉัยได้รับการพัฒนาบนพื้นฐานของการเพาะปลูกในระยะสั้นของเซลล์หรือเซลล์โมโนนิวเคลียร์เลือดที่แยกได้จากเลือดที่มีแอนติเจนของเชื้อวัณโรคในหลอดทดลองด้วยความมุ่งมั่นที่ตามมาของความเข้มข้นของ IFN-γหรือโดยการนับจำนวนของ T-lymphocytes ซึ่งสังเคราะห์ IFN-γ ความเข้มข้นของ interferon สังเคราะห์ในหลอดทดลองถูกกำหนดโดยวิธี ELISA โดยใช้โคลนอลแอนติบอดีที่มีผลผูกพันของ IFN-γ จากนั้นโดยการสอบเทียบมาตรฐาน IFN-γจะมีการกำหนดความเข้มข้นในหลอดทดสอบหรือหลุมของแผ่น

เมื่อทำการทดสอบ Elispot จำนวนของ T-limocytes สังเคราะห์ IFN-γ จะถูกนับบนพื้นผิวของแผ่นเคลือบด้วยแอนติบอดีต่อ IFN-γ

นักพัฒนา Diagnosticum บน IFN-γในหลอดทดลองผ่านการเหนี่ยวนำซึ่งได้รับอนุมัติจากหน่วยงานสำหรับยาและผลิตภัณฑ์สหรัฐอ้างว่าการทดสอบเป็นไปไม่ได้ที่จะแยกความแตกต่างระหว่างการติดเชื้อวัณโรคแฝงจากวัณโรค ดังนั้นในภูมิภาคที่มีการติดเชื้อในระดับสูงการทดสอบจะไม่ได้รับการวินิจฉัยโดยตรง อย่างไรก็ตามในประเทศของเราสามารถใช้เพื่อแยกความแตกต่างของการติดเชื้อวัณโรคในเด็กที่เป็นโรคภูมิแพ้หลังการฉีดวัคซีนและเพื่อประเมินระดับภูมิคุ้มกันเฉพาะในกระบวนการบำบัด

ปัจจุบันได้มีการศึกษาระบบการทดสอบในประเทศเพื่อหาค่าการเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ IFN-γโดยวัณโรคแอนติเจนจำเพาะในหลอดทดลอง

สถานะภูมิคุ้มกันและวัณโรคการสร้างภูมิคุ้มกัน

ในกระบวนการของการรักษาวัณโรคในมนุษย์มีการเปลี่ยนแปลงของแอนติบอดีและสถานะของระบบภูมิคุ้มกัน

ข้อมูลเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของ exudates และเนื้อเยื่อส่วนใหญ่ขัดแย้งกัน สิ่งเดียวที่สามารถสังเกตได้ด้วยเหตุผลที่ดีก็คือใน granulomas tubercular ตามกฎแล้วพบว่ามีจำนวน T-lymphocytes ที่เปิดใช้งานอยู่

มันควรจะอาศัยอยู่กับอีกสองบทบัญญัติที่จำเป็นเพื่อให้เข้าใจถึงบทบาทของกลไกภูมิคุ้มกันในการรักษาวัณโรคในมนุษย์:

• ผู้ป่วยโรคเอดส์มีอุบัติการณ์สูงเป็นพิเศษ
• (โดยไม่มีการติดเชื้อเอชไอวี) ภูมิคุ้มกันผิดปกติ (โดยเฉพาะอย่างยิ่งการเชื่อมโยง T-cell) มีความสำคัญมาก

เมื่อวัณโรคอย่างกว้างขวางใช้วิธีการต่างๆของ immunomodulation: มันเป็นหลักยาเสพติดที่ทำหน้าที่หลักในการสร้างภูมิคุ้มกัน T-cell และระบบการทำงานของ phagocytes โมโนนิวเคลียร์ (ที่ฮอร์โมน thymic, isophorone, likopid, polioksidony et al.) รวมทั้ง mycobacteria ทั้งตัว (ลดทอนลง) และส่วนประกอบของมัน

การวินิจฉัยทางอณูชีววิทยาของวัณโรค

สำหรับวิธีการทางอณูชีววิทยาในการวินิจฉัยโรคติดเชื้อ ได้แก่ ส่วนใหญ่วิธีการขึ้นอยู่กับการจัดการกับวัสดุจีโนมของเชื้อโรคแบคทีเรียและไวรัสในการระบุสารพันธุกรรมที่เฉพาะเจาะจง - ส่วนดีเอ็นเอที่มีลำดับเบสที่เฉพาะเจาะจงสำหรับประเภทหรือเชื้อโรคโดยเฉพาะอย่างยิ่งสายพันธุ์ในการวิเคราะห์ที่เฉพาะเจาะจง ลำดับดีเอ็นเอในยีนที่ตรวจสอบความไวของเชื้อโรคกับยาบางชนิดและสำหรับการวิเคราะห์การทำงาน กิจกรรมของยีนบางอย่างของเชื้อโรค เทคนิคทางชีววิทยาระดับโมเลกุลเป็นกันอย่างแพร่หลายในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์และการประยุกต์ใช้ในทางปฏิบัติในการวินิจฉัยและการตรวจสอบของการติดเชื้อแบคทีเรียและไวรัสต่างๆหลังจากที่เปิดในปี 1985 แค Myullisom (ชนะรางวัลโนเบล. 1989) โพลิเมอร์ปฏิกิริยาลูกโซ่

หลักการและความเป็นไปได้ของวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอร์

PCR ช่วยในการขยาย (คูณ) ในหลอดทดลองลำดับเบส (ส่วนดีเอ็นเอของเชื้อโรค) เป็นเวลาหลายชั่วโมงในหลายล้านครั้ง ปฏิกิริยาในกลุ่มของดีเอ็นเอเดี่ยวจะเป็นตัวกำหนดความไวที่สูงมากของการทดสอบ

ลำดับนิวคลีโอไทด์ของบางภูมิภาคในห่วงโซ่ดีเอ็นเอกำหนดอัตลักษณ์ทางพันธุกรรมของจุลินทรีย์ซึ่งจะอธิบายความจำเพาะสูงของ PCR

ค่าของเทคนิคนี้สำหรับการตรวจสอบและการตรวจสอบของลักษณะที่เกิดจากเชื้อวัณโรคลักษณะทางชีวภาพของจุลินทรีย์ที่มีการเจริญเติบโตช้ามากเวลาเป็นสองเท่าของดีเอ็นเอของเชื้อวัณโรคเมื่อเพาะเลี้ยงเป็น 12-24 ชั่วโมง

หลักการของวิธี PCR ประกอบด้วยการขยาย - หลายครั้งนับล้าน ๆ ครั้ง การคูณส่วนของลำดับดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงในหลอด microvolume ระหว่างการเกิดซ้ำของวงจรต่อไปนี้สามขั้นตอนปฏิกิริยาแต่ละที่ผ่านในระบอบการปกครองอุณหภูมิที่แตกต่างกัน:

• ขั้นตอนที่ I - denaturation ของดีเอ็นเอแบบคู่เมื่อความร้อนที่มีความแตกต่างของโซ่ของตน;
• ขั้นตอนที่สอง - การรวมตัวของไพรเมอร์ (priming oligonucleotides) กับส่วนเทอร์มินัลของโซ่ที่เฉพาะเจาะจงอย่างเคร่งครัดเลือกสำหรับการคูณของส่วนดีเอ็นเอ
• ขั้นตอนที่ III - เสร็จสมบูรณ์ของดีเอ็นเอโซ่ส่วนด้วยความช่วยเหลือของ thermostable ดีเอ็นเอโพลิเมอร์

สำหรับการขยายในหลอดทดลองต้องมีโมเลกุลของดีเอ็นเอเมทริกซ์ (nucleotides) ที่ประกอบด้วยฐานไนโตรเจนที่เกี่ยวข้อง: adenine (A), thymine (T), guanine (D), cytosine (C); สังเคราะห์ primers oligonucleotides (ไพรเมอร์) ประกอบด้วย 18-20 คู่เบส; ความร้อน DNA Polymerase เอนไซม์ที่มีอุณหภูมิที่เหมาะสม 68-72 ^ใน C, และแมกนีเซียมไอออน

ความเฉพาะเจาะจงของ PCR ขึ้นอยู่กับการเลือกส่วนดีเอ็นเอ ตามนี้ oligonucleotides เมล็ดด้านข้างจะสังเคราะห์ ความจำเพาะของการผสมผสานและความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอโซ่เป็นผลมาจากหลักการของการเสริมกันของคู่ไนโตรเจนต่อไปนี้: adenine-thymine, guanine-cytosine

เพื่อตรวจสอบจีโนมเชื้อมัยโคแบคทีเรียที่ซับซ้อนวัณโรคขยายเป้าหมายที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในระบบทดสอบส่วนใหญ่ได้รับการแต่งตั้งชิ้นดีเอ็นเอของ IS6110 ซึ่งในสายพันธุ์มากที่สุดของเชื้อวัณโรคจีโนมมีจำนวนอย่างมีนัยสำคัญ (10-20) ของการเกิดซ้ำซึ่งให้พร้อมกับความจำเพาะความไวสูงของการทดสอบ ในขณะเดียวกันสายพันธุ์ของวัณโรค Mycobacterium ที่มีจำนวนน้อยซ้ำหรือไม่มีส่วนของ IS6110 อธิบายไว้

การแยกโมเลกุลของดีเอ็นเอจากตัวอย่างทางชีววิทยา

สำหรับการทำ PCR โมเลกุลดีเอ็นเอของเชื้อโรคควรแยกออกจากวัสดุทางชีววิทยาในปริมาณน้อยที่สุดโดยมีจำนวน DNA ที่ไม่จำเพาะเจาะจงและสารยับยั้งต่างๆของเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์

การเตรียมตัวอยางควรดําเนินการภายใตเงื่อนไขเพื่อปองกันการปนเป cross cross อนเชนกันของตัวอย่างโดยโมเลกุลดีเอ็นเอที่ถูกแยก ในการทำเช่นนี้การเตรียมห้องที่มีพื้นผิวอัลตราไวโอเลตพื้นผิวและพื้นผิวการทำงานของโต๊ะและเครื่องใช้จำเป็นต้องใช้กับสารละลายที่มีคลอรีน ยังต้องใช้ถุงมือสะอาด, หลอดทดสอบและเคล็ดลับสำหรับ pipettes อัตโนมัติ

เพื่อแยกดีเอ็นเอของเชื้อวัณโรคจากตัวอย่างทางคลินิก (น้ำไขสันหลังล้างหลอดลม) ไม่ได้มีจำนวนมากของเซลล์เศษโทรศัพท์มือถือหรือเกลือดังกล่าวเพียงพอที่จะหมุนเหวี่ยงตัวอย่างที่ 3-4000. รอบต่อนาทีเพิ่มตะกอน 20-30 ยู 2% วิธีการแก้ปัญหา Triton X-100 และความอบอุ่นที่ 90 ^{เกี่ยวกับ} C เป็นเวลา 30 นาที

สำหรับการเตรียมการของกลุ่มตัวอย่างเสมหะจะต้องทำให้เป็นน้ำที่มีประสิทธิภาพซึ่งโดยทั่วไปจะใช้สำหรับการแก้ปัญหา 4% ของโซเดียมไฮดรอกไซและ N-acetyl-L-cysteine (NALC) จำนวน 50-80 มิลลิกรัมต่อตัวอย่าง - การขึ้นอยู่กับความหนืดของตัวอย่าง ควรเตรียมสารละลาย NALC ไว้ชั่วคราวหรือผง NALC สามารถใส่ลงในตัวอย่างแห้งได้โดยตรง หลังจากการทำให้เป็นของเหลวตัวอย่างควรหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 15 นาทีที่ 3.5-4,000 รอบต่อนาที (3000 กรัม) ในขวดขนาด 50 มล. ที่มีฝาเกลียวดังนี้ i. E. ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับที่แนะนำสำหรับการจัดเตรียมล่วงหน้าของเสมหะ

สำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากวิธีเม็ดถูกนำมาใช้ส่วนใหญ่มักจะอยู่บนพื้นฐานของการใช้วิธีการแก้ปัญหาของฟันกราม 5-6 guanidine isothiocyanate สลายสารเป็นอนุภาคพรุนและซิลิกอนออกไซด์ ( "ดินเบา") sorbing โมเลกุลดีเอ็นเอ สารเชิญชมรวมทั้งยับยั้งได้แล้วล้างในการแก้ปัญหา 2.5 โมลของ isothiocyanate Guanidinium และวิธีการแก้ปัญหาเอทานอลหลังจากที่โมเลกุลดีเอ็นเอจะคายน้ำและตัวอย่างเหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการดำเนินการ PCR เพื่อลดความซับซ้อนของเทคโนโลยีการสกัดดีเอ็นเอ "diatomaceous earth" มักถูกแทนที่ด้วยอนุภาคแม่เหล็กที่เคลือบด้วยซิลิคอนออกไซด์ ในกรณีนี้จะใช้ขาตั้งแม่เหล็กพิเศษสำหรับ microtubes แทนการหมุนเหวี่ยงเพื่อทำให้อนุภาคตกตะกอน

ในรัสเซียมีการพัฒนาวิธีการแยกเชื้อ mycobacteria แบบเดิมตามมาด้วยการสกัดดีเอ็นเอของเชื้อโรค สำหรับเชื้อวัณโรคแยก immunomagnetic ใช้ขนาด ferroparticles 3-5 ไมครอนเคลือบด้วยซิลิกาเพื่อที่จะเชื่อมเคมีโพลีพันธะ (กระต่าย) แอนติบอดีต่อเชื้อวัณโรค ตัวอย่างของเสมหะหลังการแยกด้วยอัลคาไลน์จะถูกทำให้เป็นกลางด้วยสารละลายไตรคลอรีนที่เป็นกรดและนำไปผสมกับตัวดูดซับภูมิคุ้มกัน จากนั้นอนุภาคภูมิคุ้มกันจะถูกเก็บรวบรวมด้วยแกนแม่เหล็กที่มีปลายที่ถอดเปลี่ยนได้ถ่ายโอนไปยังตัวจุลภาคและเกิดการตกตะกอน เติมสารละลาย Triton X-100 2% และอุ่นเป็นเวลา 30 นาทีที่^{อุณหภูมิ} 90 ^องศาเซลเซียสนำ supernatant ใช้เป็นตัวดีเอ็นเอสำหรับการวิเคราะห์ PCR

ปัญหาที่ยากคือการแยกตัวอย่างดีเอ็นเอจากเชื้อวัณโรค mycobacterium tuberculosis จากชิ้นเนื้อเยื่อ สำหรับเอนไซม์ไบโอเอนไซม์เอนไซม์โปรตีนase K จะถูกใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 200-500 มิลลิกรัมต่อลิตรที่อุณหภูมิ 56 ^องศาเซลเซียสข้ามคืน นอกจากนี้หนึ่งในวิธีการที่รู้จักใช้ DNA ที่ไม่จำเพาะส่วนเกินในการวิเคราะห์ PCR ของ biopsies มักเป็นสาเหตุของการยับยั้งการเกิดปฏิกิริยาซึ่งจะต้องมีการสกัดดีเอ็นเอซ้ำ ๆ

วิธีการตรวจจับผลลัพธ์

หลังจากเสร็จสิ้นการทำปฏิกิริยาแล้วชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ขยายตัวของเชื้อโรคจะถูกระบุด้วยวิธีการต่างๆ

วิธีการเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสเป็นที่รู้จักกันดี ส่วนดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นจะถูกระบุโดยการควบคุมเชิงบวกที่มีส่วนของดีเอ็นเอเฉพาะที่ต้องการหรือตามขนาดที่ทราบ (จำนวนคู่ของ nucleotide) ของชิ้นส่วนซึ่งกำหนดโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลมาตรฐาน

ในการปรากฏตัวของสีย้อมที่เฉพาะเจาะจง ethidium bromide จะรวมอยู่ในดีเอ็นเอแบบ double-stranded ส่วนดีเอ็นเอสังเคราะห์ถูกตรวจพบว่าเป็นแถบที่ส่องสว่างภายใต้การกระทำของรังสีอัลตราไวโอเลต

ขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่กำหนดโดย electrophoresis จากระยะไกลตั้งแต่เริ่มต้นจะต้องสอดคล้องกับเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลที่รู้จักหรือการควบคุมในเชิงบวก

วิธีการอื่น ๆ ของการกำหนดผล PCR อยู่บนพื้นฐานของการผสมพันธุ์ของห่วงโซ่เดียวผลิตภัณฑ์ PCR กับ oligonucleotide ประกอบการขออนุญาต - สอบสวนดีเอ็นเอที่มีป้ายกำกับไบโอตินตามด้วยการตรวจสอบผ่านทางปฏิกิริยาเอนไซม์เช่นโดยการเชื่อมโยงไปยัง streptavidin-ไบโอตินฟอสฟาอัลคาไลน์

จากการตรวจจับชนิดนี้เครื่องวิเคราะห์ PCR ได้ถูกสร้างขึ้นเพื่อตรวจจับผล PCR โดยอัตโนมัติเมื่ออ่านความหนาแน่นของแสงในตัวอย่างหลังจากการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม์

ข้อเสียของวิธีการเหล่านี้คือความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนภายในห้องด้วยชิ้นส่วนโมเลกุลดีเอ็นเอสั้น ๆ เมื่อโมเลกุลป้อนตัวอย่างใหม่จะกลายเป็นเมทริกซ์สำหรับ PCR และนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ผิดพลาด

ในเรื่องนี้เพื่อป้องกันผลบวกเท็จกฎที่เข้มงวดสำหรับการแยกและการแยกสถานที่จะนำมาใช้: การสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างทางชีวภาพ; สถานที่สำหรับการตรวจสอบผล (electrophoresis) จากเขตปลอดเชื้อ สถานที่เหล่านี้เป็นพื้นที่ที่อาจเกิดการปนเปื้อน อีกพื้นที่ที่แยกเป็นห้องที่สะอาดสำหรับการแนะนำตัวอย่างดีเอ็นเอที่จะทดสอบในท่อที่มีส่วนผสมของปฏิกิริยาสำหรับ PCR ในที่สุดก็สันนิษฐานว่าอุปกรณ์หลัก - ดีเอ็นเอ - เครื่องขยายเสียง - ควรจะวางไว้ในที่แยกต่างหากอาจสำนักงานห้อง

เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาก่อนหน้านี้ - บางการทดสอบระบบ Likon แอมป์ PCR แทน dezoksinukleozidtimidina ประกอบด้วย dezoksinukleoziduridin ซึ่งเมื่อในหลอดทดลองวงจรสังเคราะห์แทนนิติบุคคลที่จัดตั้งขึ้นในตำแหน่งที่เหมาะสมกล่าวคือ ฐานไนโตรเจนของดีมัยในดีเอ็นเอพื้นเมืองจะถูกแทนที่ด้วย uracil glycosylase Uracil-DNA เพิ่มส่วนผสมของปฏิกิริยาลงในวัสดุที่อยู่ภายใต้การวิเคราะห์ทำลายเฉพาะเศษปนเปื้อนที่มี deoxyuridine แต่ไม่ได้วิเคราะห์ DNA พื้นเมือง lt; / RTI & gt; ความร้อนที่ 94 ^องศาเซลเซียสจะทำให้เอนไซม์นี้ไม่ทำงานและไม่รบกวนการขยายตัวของ PCR

มีระบบทดสอบขึ้นอยู่กับการขยายความเข้มข้นของ rRNA ซึ่งเป็นการถอดและสังเคราะห์โมเลกุลดีเอ็นเอแบบย้อนกลับเป็นครั้งแรก ซึ่งในที่สุดก็เป็นเมทริกซ์สำหรับการสังเคราะห์โมเลกุลของอาร์เอ็นเอ RNA amplicons ตรวจพบโดยใช้ตัวตรวจดีเอ็นเอที่มีคราบ acridine เมื่อถูกไฮบริดไดด์ในสารละลายของหลอดปฏิกิริยา วิธีนี้นอกเหนือจากความไวสูงมีข้อได้เปรียบในการวิเคราะห์ในท่อซึ่งช่วยป้องกันการปนเปื้อน ตามที่ผู้เขียนความไวของวิธีการนี้ในตัวอย่างทางเดินหายใจถึง 90% ด้วยความจำเพาะของ 99-100%

มีการใช้วิธีการตรวจจับแบบใหม่ในแบบ real-time PCR วิธีการเหล่านี้แตกต่างกันไปในขั้นตอน PCR และการตรวจจับผลการทดสอบจะดำเนินการพร้อม ๆ กันในท่อปิดเดียว เทคนิคนี้ไม่เพียงช่วยลดความซับซ้อนของเทคนิคในการวิเคราะห์ แต่ยังช่วยป้องกันการปนเปื้อนของห้องทดลองและตัวอย่างทดสอบด้วยผลิตภัณฑ์จาก PCR ก่อนหน้า

ในแบบ real-time PCR ผลการตรวจสอบเกิดจากการเรืองแสงที่เกิดขึ้นในระหว่างการแจง DNA hybridization สอบสวนกับ amplifitsi Rui-PCR ระหว่างชิ้นดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจง ยานสำรวจโครงสร้างดีเอ็นเอแจงสร้างเพื่อให้เครื่องหมายเรืองแสงถูกปล่อยออกมาเป็นผลมาจากปฏิกิริยาของเอนไซม์หรือห่างไกลจากการเรืองแสงดับโมเลกุลเฉพาะภายใต้การผสมพันธุ์เฉพาะกับโมเลกุลดีเอ็นเอที่ต้องการที่จะขยายในช่วง PCR ขณะที่จำนวนของโมเลกุลสอบสวนไฮบริดที่มีเพิ่มขึ้นในการเรืองแสงเป็นสัดส่วนให้อยู่ในระดับที่ตรวจพบจำนวนของโมเลกุลของผลิตภัณฑ์ที่ขยาย เนื่องจากในแต่ละจำนวนวงจรของ PCR ชิ้นดีเอ็นเอโมเลกุลคูณครึ่งจำนวนรอบที่เรืองแสงจะถูกกำหนดและเพิ่มสัดส่วนผกผันกับจำนวนของโมเลกุลของดีเอ็นเอในตัวอย่างเริ่มต้น หากเกิดปฏิกิริยาคือการแนะนำเป็นสอบเทียบหลายระดับความเข้มข้นที่รู้จักกันที่แตกต่างกันของโมเลกุลของชิ้นดีเอ็นเอของเชื้อวัณโรคที่สอดคล้องกันโดยใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์สามารถคำนวณและปริมาณของดีเอ็นเอในวัสดุทดสอบ

ตัวอย่างมาตรฐานแต่ละตัวถูกทำซ้ำ เกณฑ์เชิงปริมาณเป็นจำนวนขั้นต่ำของวัฏภาค PCR ที่จำเป็นสำหรับการเริ่มต้นและการเติบโตของค่าเรืองแสงที่กำหนด ในการตัดสิทธิ์ - จำนวนรอบ เส้นสายคือค่าเรืองแสง ความเข้มข้นของดีเอ็นเอมีสัดส่วนผกผันกับจำนวนรอบที่ต้องใช้สำหรับการฟลูออเรสเซนต์ ในคอลัมน์ด้านขวา (21-32) จะมีการทำเครื่องหมายหมายเลขวงจรสำหรับความเข้มข้นที่สอดคล้องกัน ความแตกต่างระหว่างความเข้มข้น 10 เท่าของดีเอ็นเอ 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 รอบ สำหรับผู้ป่วยสองรายความเข้มข้นของชิ้นส่วน IS6110 มีค่าประมาณ 10 ³ / ml และ 10 ⁴ / ml โดยพิจารณาจากจำนวนซ้ำ (6-20) ของชิ้นส่วนที่วิเคราะห์ในจีโนมของ Mycobacterium tuberculosis จำนวนแบคทีเรีย myco ในตัวอย่างทางคลินิกประมาณ 100 และ 1000 เซลล์ตามลำดับ

การใช้ PCR ในการวินิจฉัยวัณโรค

วิธี PCR ใช้มากที่สุดในการวินิจฉัยวัณโรคอย่างเร่งด่วน - การตรวจหาเชื้อวัณโรคในตัวอย่างทางคลินิก: เสมหะ การชลประทานหลอดลมเยื่อหุ้มปอด, exudat, ปัสสาวะ, น้ำไขสันหลังู, punctate osteolysis, aspirates aspibals หญิงและชิ้นเนื้อต่างๆ เมื่อศึกษาเกี่ยวกับตัวอย่างเสมหะและหลอดลมจากผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรควัณโรคปอดในประเทศเนเธอร์แลนด์จำนวน 500 รายความไวเปรียบเทียบของ PCR การเพาะเลี้ยงและการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ ความไวในการวิเคราะห์เท่ากับ 92.6.88.9 และ 52.4% ตามลำดับ ความจำเพาะของวิธีการทั้งหมดประมาณ 99%

เปรียบเทียบประสิทธิภาพของการตรวจหาเชื้อวัณโรคจากเชื้อรา Mycobacterium tuberculosis โดยวิธีการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ smear การเพาะในอาหาร Levenstein-Jensen, ระบบการทดสอบ VASTES และการวิเคราะห์ PCR PCR มีความไว 74.4%, กล้องจุลทรรศน์ - 33.8%, เมล็ดที่มีความหนาแน่นปานกลาง - 48.9% และ VASTES - 55.8% เวลาในการตรวจจับเฉลี่ยสำหรับการเพาะบนอาหาร Levenstein-Jensen คือ 24 วัน VASTES - 13 วัน, PCR - 1 วัน

ความเป็นไปได้ในการใช้ PCR เป็นวิธีการที่สำคัญและรวดเร็วสำหรับการตรวจสอบประสิทธิภาพของการรักษาวัณโรคยังกล่าวถึง

การตรวจหาดีเอ็นเอของเชื้อวัณโรคโดยวิธี PCR กับยาเคมีบำบัดที่มีประสิทธิภาพมากกว่าที่กำหนดเป็นเวลานาน - โดยเฉลี่ย 1.7 เมื่อเทียบกับเดือน smear ที่กำหนดไว้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและ 2.5 เดือนเมื่อเทียบกับการตรวจสอบแบคทีเรีย

การวินิจฉัยรูปแบบนอกวัณโรควัณโรค

ราคาเป็นวิธี PCR มีความละเอียดอ่อนที่มีขนาดใหญ่โดยเฉพาะอย่างยิ่งในรูปแบบนอกปอดเป็นรูปแบบภายใต้วิธีแบคทีเรียเหล่านี้ทางคลินิกและวิธีการถ่ายภาพรังสีธรรมดาสำหรับการตัดสินใจของเชื้อวัณโรคในวัสดุวินิจฉัยไม่ได้ผล

ในการตรวจสอบตัวอย่างปัสสาวะผล PCR เป็นบวกใน 16 จาก 17 ผู้ป่วยวัณโรคที่ใช้งานและปัสสาวะเชิงลบของผู้ป่วยวัณโรคที่ไม่ใช้งาน 4 การทำงานของไตและผู้ป่วย 39 กับระบบทางเดินปัสสาวะโรค nontubercular

ประสิทธิภาพของการวิเคราะห์ PCR ในการศึกษาไขสันหลังอักเสบของกระดูกในผู้ป่วยที่มีไข้ไม่ทราบสาเหตุได้แสดงให้เห็นในกรณีที่สงสัยว่าเป็นวัณโรค เพื่อวินิจฉัยวัณโรคต่อมน้ำเหลืองจำนวน 102 รายและตัวอย่างชิ้นเนื้อเยื่อของเด็กจำนวน 67 คนที่สงสัยว่าเป็นวัณโรคที่เป็นต่อมน้ำเหลืองในเด็ก ได้ผลลัพธ์ที่เป็นบวก: PCR แบบเรียลไทม์ 71.6% กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง - 46.3% การวิจัยทางวัฒนธรรม - 41.8% ในการศึกษาการตัดชิ้นเนื้อต่อมน้ำเหลือง 50 รายในผู้ป่วยที่เป็นโรค "cat scratch" ผลการทดสอบทั้งหมดมีค่าเป็นลบ ดังนั้นจึงมีความจำเพาะเจาะจงในการวิเคราะห์ PCR ถึง 100% ในงานเดียวกันกับการเจาะชิ้นเนื้อของต่อมน้ำหลืองมีการตรวจพบเชื้อ M. Avium

การวินิจฉัยวัณโรคของภาวะมีบุตรยากของอวัยวะเพศหญิงเป็นที่รู้จักกันเป็นหนึ่งในปัญหาที่ยากที่สุดในการวินิจฉัย เมื่อตรวจสอบโดยวิธี PCR ตรวจชิ้นเนื้อของมดลูก, เยื่อบุโพรงมดลูก aspirates ตัวอย่างของเหลวจากดักลาสพื้นที่ 14 (56%) ของผู้ป่วยที่สงสัยว่า 25 ตรวจสอบการ laparoscopically วัณโรคผลบวกที่ได้รับ การใช้กล้องจุลทรรศน์และการทดสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์และผลการทดลองพบว่า 1 และ 2 ผลตามลำดับ กรณีเหล่านี้เป็น PCR-positive ผล PCR-positive ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับกรณีที่มีลักษณะอาการของวัณโรคตามการศึกษาทางเนื้อเยื่อ; จำนวนน้อย - ด้วยความสงสัยของวัณโรคตามข้อมูล laparoscopy ผลการวิเคราะห์ PCR ในเชิงบวกเพียงอย่างเดียวก็คือเมื่อไม่มีข้อมูล laparoscopic สำหรับวัณโรค

เมื่อวินิจฉัยรูปแบบนอกวัณโรควัณโรคแพทย์มักจะมีคำถามเกี่ยวกับความเป็นไปได้ในการตรวจหาเชื้อโรคเมื่อทำการทดสอบตัวอย่างเลือดด้วยวิธี PCR ข้อมูลที่เป็นวรรณคดีระบุว่าการตรวจหาดีเอ็นเอจากเชื้อวัณโรคจากเชื้อวัณโรคจากตัวอย่างเลือดเป็นไปได้ด้วยรูปแบบการติดเชื้อเอชไอวีในวงกว้าง DNA ของ mycobacterium tuberculosis ถูกตรวจพบเฉพาะกับวัณโรคทั่วไปของอวัยวะต่าง ๆ ในผู้ป่วยไตเทียมและ immunosuppression

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

การระบุชนิดของ mycobacteria

วิธี PCR สามารถจะค่อนข้างมีประสิทธิภาพสำหรับการระบุอย่างรวดเร็วของเชื้อมัยโคแบคทีเรียวัณโรคที่ซับซ้อนและบางสายพันธุ์ของเชื้อมัยโคแบคทีเรีย nontubercular หลังจากที่ได้รับการเจริญเติบโตของพวกเขาเริ่มต้น ในกรณีนี้การใช้ PCR สามารถบันทึกได้ 7-10 วันซึ่งจำเป็นสำหรับการระบุตัวตนทางวัฒนธรรมที่ตามมาของผลในเชิงบวก การทดสอบด้วยวิธี PCR ทำได้ง่ายมากเนื่องจากไม่จำเป็นต้องมีการจัดเตรียมตัวอย่างวัสดุที่ซับซ้อนเพื่อให้ได้ความไวสูง ในการศึกษา 80 ในเชิงบวกในระบบการทดสอบนี้ ( บริษัท MB Vasto. ออร์กานอน) ทุกวัฒนธรรมในเชิงบวกของ PCR อย่างเคร่งครัดที่เฉพาะเจาะจงและจัดขึ้นเป็นเวลา 1 วัน เพื่อระบุชนิดอื่น ๆ ของเชื้อมัยโคแบคทีเรียในการเตรียมดีเอ็นเอของวัฒนธรรมเชื้อโรคไฮบริดที่มีดีเอ็นเอโพรบที่เฉพาะเจาะจงที่มีป้ายกำกับ acridine และสายพันธุ์ที่ตรวจพบโดยการปรากฏตัวของ chemiluminescence ผ่าน chemiluminometer หรือ nitrocellulose แถบที่มีการประเมินภาพหลังจากผสมพันธุ์ ด้วยความช่วยเหลือของชุดดังกล่าวจะมีการระบุชนิดของสิ่งมีชีวิตจำนวน จำกัด : mycobacterium tuberculosis complex M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii และ M. Gordonae

A.Telenti et al. นอกจากนี้ยังมีการพัฒนาวิธีการที่ค่อนข้างง่ายและราคาไม่แพงของประชาชนชนิดของสายพันธุ์ที่สำคัญทางคลินิกของเชื้อมัยโคแบคทีเรียโดยวิธี PCR และการรักษาที่ตามมาด้วยสอง จำกัด เอนไซม์ (เอนไซม์ที่มีคุณสมบัติตัดโมเลกุลดีเอ็นเอที่จุดที่เฉพาะเจาะจง) ส่วนดีเอ็นเอถูกขยาย (65 kDa) และชิ้นส่วน PCR ของ 439 คู่ของ nucleotide ที่ผลิตโดย PCR จะถูกแยกออกจากกันด้วยเอนไซม์สองชนิดคือ Bste II และ Nae III แล้ววิเคราะห์โดยใช้เจล agarose ข่าวคราวที่ได้รับสองผลิตภัณฑ์การกำหนดขนาดของพวกเขา (จำนวนฐานคู่) โดยใช้ชุดมาตรฐานของดีเอ็นเอ (โมเลกุลดีเอ็นเอเครื่องหมาย) ยาว 100-1000 ฐานคู่ ในแต่ละประเภทโดยเฉพาะ (วัณโรค, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) ตรวจสอบสองหรือสามชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดแตกต่างกันสำหรับแต่ละเอนไซม์ จำกัด การรวมกันของขนาดดีเอ็นเอที่แตกต่างกันทำให้สามารถแยกความแตกต่างระหว่างชนิดเหล่านี้ได้

มีการพัฒนาเทคโนโลยีของ microarrays DNA ชีวภาพ ซึ่งจะช่วยระบุ mycobacteria มากกว่า 100 ชนิดในการศึกษาครั้งเดียว

การระบุชนิดสามารถทำได้โดยการขยาย PCR ของภูมิภาคตัวแปร rSR 16S ตามด้วยการเรียงลำดับแอมพิสันเมื่อเทียบกับโครงสร้างหลักที่สอดคล้องกันซึ่งช่วยในการระบุมากกว่า mycobacteria กว่า 40 ชนิด

ด้วยความช่วยเหลือของ PCR การระบุชนิดของเชื้อวัณโรคภายใน mycobacterium tuberculosis complex สามารถทำได้เช่นความแตกต่างของ M. Bovis และ M. Bovis BCG เมื่อต้องการทำเช่นนี้การมีหรือไม่มียีนบางตัวในบริเวณจีโนมของ RD1 จะถูกวิเคราะห์ RD9 และ RD10 RD1 ไม่พบใน M. Bovis BCG แต่มีอยู่ในสายพันธุ์ที่รุนแรงเช่น M. Bovis

การกำหนดความไวของยา Mycobacterium tuberculosis โดย PCR

วัตถุประสงค์ของการใช้วิธีทางอณูพันธุศาสตร์สำหรับความไวต่อยาหรือความต้านทานของเชื้อวัณโรคลดการระบุการกลายพันธุ์ในลำดับเบสของยีนเฉพาะที่รู้จักกัน วิธีการขั้นพื้นฐานจะขึ้นทั้งใน prochityvanii โดยตรง (ลำดับ) ของลำดับเหล่านี้หลังจากที่การขยายหรือการผสมพันธุ์ของไบโอตินที่ติดฉลากดีเอ็นเอขยายช่วง probes PCR ดีเอ็นเอ ทางเลือกทั้งสองเกี่ยวข้องกับการระบุแทนเบื่อหน่ายในลำดับที่การใช้ดีเอ็นเอโพรบนำไปสู่การขาดหรือการผสมพันธุ์ที่ไม่สมบูรณ์จะเมมเบรน nitrocellulose โดยใช้เอนไซม์คอนจูเกต (สเตอัลคาไลน์ฟอสฟา) - วิธี LIPA-Rif-TB

วิธีการวัดการเรืองแสงในการแก้ไขภายใน microsections ดีเอ็นเอ probes ประกอบกับการกลายพันธุ์ที่รู้จักกันดีในภูมิภาคยีน PCR ขยายความรับผิดชอบในการต้านทานหรือความไวยาเสพติดเรียกว่าวิธีการ mikrobiochipov ขั้นตอนสำคัญสำหรับการวิจัยครั้งนี้มีดังนี้ หลังจากการแยกดีเอ็นเอจากตัวอย่างทางคลินิกหรือวัฒนธรรมของเชื้อมัยโคแบคทีเรียเป็นสิ่งจำเป็นที่จะดำเนินการขยาย PCR ของชิ้นส่วนที่เกี่ยวข้องของยีน rpoB รับผิดชอบเพื่อความไวของยา rifampicin หรือ katG และ Inha ยีนโปรตีนของเชื้อมีความรับผิดชอบในความไวในการ Isoniazid ผล PCR ได้รับการประเมินโดยข่าวคราว agarose ซึ่งยืนยันการรับของดีเอ็นเอที่เหมาะสมของความยาวที่ต้องการ จากนั้นจะมีการทำ PCR รอบที่สองเพื่อแนะนำฉลากเรืองแสงลงในดีเอ็นเอ ผลของ PCR ได้รับการยืนยันอีกครั้งโดยเจลอิเล็กโตรโฟเรซิส หลังจากนั้นเป็นต้นมาผสมพันธุ์ได้ดำเนินการ (การบ่มค้างคืน) ตามด้วยการล้างวัตถุอันเป็นผลบน biochip ซึ่งเป็นจำนวนมากของการแก้ไขในแผ่นกระจกขนาดเล็กดีเอ็นเอสั้น (ฟิวส์) ซึ่งจะประกอบ nucleotide ลำดับของยาเสพติดที่มีความอ่อนไหวชนิดเชื้อวัณโรคที่จุดของการกลายพันธุ์ที่เป็นไปได้ เช่นเดียวกับลำดับการกลายพันธุ์ที่มีความรับผิดชอบต่อการต่อต้านยาเสพติด สถานที่ตั้งของดีเอ็นเอโพรบบนจาน - กำหนดอย่างเคร่งครัดและระดับของการเรืองแสงสังเกตเมื่อผสมพันธุ์เพื่อตรวจสอบผลการใช้อุปกรณ์การอ่านเป็นพิเศษคือการติดตั้ง ในการนี้ผลของการวิเคราะห์จะถูกกำหนดโดยโปรแกรมคอมพิวเตอร์พิเศษ

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาได้มีการพัฒนาวิธีการอื่นในการกำหนดความไวของยาในวัณโรค mycobacteria บนพื้นฐานของเทคโนโลยี PCR แบบเรียลไทม์ซึ่งทำให้การศึกษาเหล่านี้สามารถทำได้ในการทดสอบแบบปิดหลอด

ในรูปที่ 13-13 นำเสนอผลการวิเคราะห์วัฒนธรรมทางคลินิกของวัณโรค mycobacterium ในการกำหนดความต้านทานต่อยาเสพติด rifampicin โดย PCR เรียลไทม์: 218 - ตัวอย่างการควบคุม (ไวต่อยา rifampicin); 93 - การควบคุมบวกสำหรับการกลายพันธุ์ของ Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - การควบคุมบวกสำหรับการกลายพันธุ์ของ Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - ตัวอย่างการทดลอง ผลการคำนวณหาค่าไคเนติกสเกลของการขยายตัว 4 ช่องทาง: ช่อง 1: 393 - การบวกการควบคุมการกลายพันธุ์ของ Ser-Trp TCG-TGG; ช่อง 2: 4482 - การควบคุมบวกสำหรับการกลายพันธุ์ของ Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - ตัวอย่างการทดลอง ช่อง 4: เส้นโค้งจลศาสตร์ของการขยายตัวอย่างทั้งหมดที่เข้าร่วมในการทดลอง การควบคุมบวกของการขยายสัญญาณ จากผลการวิเคราะห์พบว่ามีการระบุการกลายพันธุ์ที่มีผลต่อความต้านทานต่อยา rifampicin ในตัวอย่าง 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG หลักการเดียวกันนี้ใช้ในการกำหนดความต้านทานต่อยา isoniazid สำหรับยีน catG และ inhA ซึ่งเป็นตัวกำหนดการกลายพันธุ์ที่พบบ่อยที่สุด

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

การระบุชนิดของ mycobacterium tuberculosis

วิธีการส่วนใหญ่มีการศึกษาอย่างละเอียดของบัตรประจำตัวของสายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคเป็นเทคนิคที่เรียกว่าข้อ จำกัด ความยาวส่วน polymorphism (RFLP RFLP. หรือในฉบับภาษาอังกฤษ) และที่อยู่บนพื้นฐานของ fragmentirovanin (ข้อ จำกัด ) เอนไซม์เชื้อวัณโรคดีเอ็นเอ PVU ครั้งที่สองและชิ้นส่วนที่ได้รับการผสมพันธุ์ตามมาด้วยลำดับที่เฉพาะเจาะจงบางอย่างในดีเอ็นเอ องค์ประกอบซ้ำ IS6110 ความแตกต่างระหว่างอินทราเน็ตเกิดขึ้นเนื่องจากจำนวนซ้ำของ IS6110 และตำแหน่งของ DNA ที่แตกต่างกัน รวมถึงความหลากหลายของระยะทางระหว่างจุดโจมตีของเอนไซม์ที่ จำกัด เอนไซม์บางตัว (ไซต์ที่ จำกัด ) และองค์ประกอบ IS6110 เทคโนโลยีนี้มีความซับซ้อนและใช้เวลานาน หลังการรักษาด้วยดีเอ็นเอที่สกัดจากวัฒนธรรมของเชื้อวัณโรคที่ gel electrophoresis จะดำเนินการกับเอนไซม์ จำกัด และจากนั้นก็ย้ายชิ้นส่วนดีเอ็นเอของความยาวแตกต่างกันในเมมเบรน nitrocellulose ที่ผสมพันธุ์ได้ดำเนินการกับชิ้นส่วนของ IS6110 องค์ประกอบและตรวจพบโดยวิธีการของปฏิกิริยาของเอนไซม์ รูปแบบที่เฉพาะเจาะจงที่เกิดขึ้นของแถบลักษณะดีเอ็นเอของสายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงของ Mycobacterium tuberculosis ด้วยความช่วยเหลือของการวิเคราะห์ทางคอมพิวเตอร์ตัวตนหรือความสัมพันธ์ของสายพันธุ์จะถูกเปิดเผย อย่างไรก็ตามข้อเท็จจริงที่ว่าวิธีการ RFLP เป็นข้อเลือกที่เหมาะสมที่สุด ระบุจำนวนที่ใหญ่ที่สุดของสายพันธุ์ที่แตกต่างในการวิเคราะห์ก็ไม่ได้ผลสำหรับจำนวนน้อย (น้อยกว่า 5) IS6110-ซ้ำสังเกตในบางสายพันธุ์ ในรูปที่ 13-14 แสดงผลลัพธ์ของการพิมพ์ RFLP ของสายพันธุ์

ทางเลือกอาจเป็นวิธีการ spoligotyping - การวิเคราะห์ความหลากหลายของดีเอ็นเอ spacer - กลางระหว่างการทำซ้ำโดยตรงของภูมิภาค DR เมื่อดำเนินการ spoligotyping ของสายพันธุ์, PCR จะดำเนินการกับไพรเมอร์ที่ล้อมรอบภูมิภาค DR หลังจากที่มีชิ้นส่วนของความยาวที่แตกต่างกันจะเกิดขึ้นซึ่งผสมพันธุ์กับภูมิภาคกลางตัวแปรของดีเอ็นเอ การวิเคราะห์ลำดับการแบ่งตัวของพื้นที่ DR ถูกนำเสนอ ตามที่นักวิจัยง่ายขึ้นมีประสิทธิภาพและเหมาะสำหรับการคัดกรองเบื้องต้นของสายพันธุ์และการวิเคราะห์ทางระบาดวิทยาเบื้องต้นเช่นเดียวกับการวิจัยวัสดุทางคลินิกโดยตรง

เห็นได้ชัดว่าวิธีการที่เข้าถึงได้ง่ายและมีประสิทธิภาพมากขึ้นคือ VNTR (คำย่อของคำภาษาอังกฤษ) หรือวิธีการกำหนดจำนวนตัวแปรของการตีคู่ครั้งที่แน่นอนใน DNA ของ mycobacterium tuberculosis วิธีนี้ใช้เฉพาะในการใช้ PCR และไม่จำเป็นต้องมีการจัดการเพิ่มเติม เนื่องจากจำนวนของการทำซ้ำแบบทวีคูณในแต่ละสายพันธุ์และที่แตกต่างกัน loci แตกต่างกันชิ้นส่วนของขนาดต่างๆจะถูกกำหนดและวิเคราะห์บน electrophoregram ที่เกิดขึ้นของผลิตภัณฑ์ PCR ตามที่นักวิจัยใช้ VNTR ประสบความสำเร็จในการแยกแยะความแตกต่างของสายพันธุ์มากกว่าวิธี RFLP

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีการให้ความสนใจกับการแพร่ระบาดของสายพันธุ์ Mycobacterium tuberculosis ของครอบครัว W-Beijing (ซึ่งบางครั้งเรียกว่าสายพันธุ์ปักกิ่ง) ซึ่งส่วนใหญ่เป็นยาต้าน

ความต้องการพื้นฐานเกี่ยวกับคุณภาพของการวิจัยทางชีววิทยาระดับโมเลกุล

[72], [73], [74], [75],

เอกสารทางกฎหมายขั้นพื้นฐานสำหรับ PCR

สั่งซื้อรัสเซียกระทรวงสาธารณสุข: №45จาก 2000/07/02 กรัม .. จำนวน 109 กรัมจาก 2003/03/21 .. หมายเลข 64 จาก 2000/02/21, แนวทาง: 1.3.1888-04 "องค์กรของการทำงานในการศึกษาโดยใช้วัสดุ PCR ติดเชื้อที่ทำให้เกิดโรคทางชีวภาพ ตัวแทนของกลุ่ม III-IV ของการทำให้เกิดโรค "; 1.3.1794-03 "องค์การแห่งการทำงานในการศึกษาวัสดุ PCR ที่ติดเชื้อจุลินทรีย์ของกลุ่มก่อให้เกิดโรค I-II" 2003. 3.5.5.1034-01 "ปนเปื้อนของวัสดุที่ติดเชื้อแบคทีเรีย I-IV กลุ่มโรคเมื่อใช้วิธี PCR" 2001 ภาคผนวก 11 ถึงคำแนะนำวิธีการแบบครบวงจรสำหรับการตรวจสอบทางจุลชีววิทยาในการระบุการวินิจฉัยและการรักษาวัณโรค

[76], [77], [78]

พนักงาน

การดำเนินการของการวิจัยทางชีววิทยาโมเลกุลอาจจะมีแพทย์วินิจฉัยทางคลินิกห้องปฏิบัติการ bacteriologists แพทย์นักไวรัสวิทยา, แพทย์, นักชีววิทยาคลินิกวินิจฉัยโรคเช่นเดียวกับผู้เชี่ยวชาญทางการแพทย์ที่มีการศึกษาระดับมัธยมศึกษาที่ผ่านความเชี่ยวชาญและการฝึกอบรมขั้นสูงในลักษณะที่กำหนด

การจัดห้องปฏิบัติการ

ต้องมีห้องปฏิบัติการต่อไปนี้:

• บริเวณที่ทำการจัดการตัวอย่างคือห้องปฏิบัติการที่เหมาะสำหรับการทำงานร่วมกับเชื้อโรคที่ติดเชื้อของกลุ่มที่ก่อให้เกิดโรค III-IV ตามคำแนะนำแบบมีระเบียบ 13.1888-04
• โซนสำหรับเตรียมสารผสมปฏิกิริยา PCR - ห้องปฏิบัติการซึ่งช่วยป้องกันการปนเปื้อนภายในห้องปฏิบัติการ - เขต "สะอาด"
• •หากมีการใช้เทคโนโลยีอิเล็คโทรโดเรอซิสหรือไฮบริไดซ์เพื่อวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR ห้องพักห้องปฏิบัติการที่คูณดีเอ็นเอที่สกัดจากท่อและขยายตามลำดับอาจได้รับในสภาพแวดล้อมที่สอดคล้องกับความต้องการสำหรับห้องปฏิบัติการ PCR (1.3.1794-03 แนวทางการแนะแนว 1.3.1888-04) จะต้องได้รับอย่างเต็มที่ ถูกแยกออกจากสถานที่ที่ระบุไว้ในย่อหน้าก่อนหน้า มันควรจะได้รับการยกเว้นจากโซนเคลื่อนไหวเพื่อโซน electrophoresis สำหรับการจัดการตัวอย่างและพื้นที่ "สะอาด" ของบุคลากรอุปกรณ์วัสดุใด ๆ และวัตถุเช่นเดียวกับการถ่ายโอนของอากาศผ่านระบบระบายอากาศหรือเป็นผลมาจากร่าง โซนนี้ไม่จำเป็นสำหรับการตรวจจับผลิตภัณฑ์ PCR ด้วย fluorimetric
• ห้องสำหรับการจัดทำเอกสารและการประมวลผลผลงานมีพร้อมกับคอมพิวเตอร์และอุปกรณ์สำนักงานที่จำเป็น ห้องนี้อาจมีอุปกรณ์ตรวจจับผลิตภัณฑ์ PCR โดยไม่ต้องเปิดหลอด - เครื่องตรวจจับเรืองแสง PCR และเครื่องทดสอบความร้อนสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์

ข้อกำหนดด้านสุขอนามัยและระบาดวิทยาสำหรับการรักษาเสมหะเบื้องต้นคล้ายกับข้อกำหนดด้านจุลชีววิทยามาตรฐานสำหรับการทำงานกับวัณโรค mycobacteria

[79], [80], [81], [82],

เสร็จสิ้นการตรวจวิเคราะห์ PCR ในห้องปฏิบัติการ

ห้องปฏิบัติการรวมถึงอุปกรณ์สำหรับห้องพักต่อไปนี้

• ห้องสำหรับการเตรียมตัวอย่างนั้นประกอบด้วยอุปกรณ์ต่อไปนี้: ลาเท็กซ์ของชั้นป้องกัน II "SP-1.2": เทอร์โมสแตทแบบ solid-state พร้อมฝาปิดทำความร้อนสำหรับหลอดทดสอบ "Eppendorf"; microcentrifuge ที่ 13,000 รอบต่อนาที; เครื่องหมุนเหวี่ยง (Vortex); ตู้เย็นที่มีอุณหภูมิตั้งแต่ -20 ^{ไปยัง} C 10 ถึง^{เกี่ยวกับ} C; pipettes ของปริมาณตัวแปรของชุด "Rroline"; ปั๊มที่มีขวดดักจับ OM-1; ขาตั้งสำหรับปิเปต; ขาตั้งกล้อง 200x0.5 มล. ขาตั้งกล้อง 50x1.5 มิลลิลิตร; แท่นวางสำหรับจัดเก็บหลอดทดสอบ 80x1.5 มล.
• ห้องเตรียมปฏิกิริยาปฏิกิริยา: กล่องป้องกัน PCR-box ("Laminar-C 110 ซม.); centrifuge - Vortex; ปิเปตปริมาณปริมาตรของ Proline series; ขาตั้งสำหรับปิเปต; ขาตั้งกล้อง 200x0.2 มิลลิลิตร; แท่นวางสำหรับจัดเก็บหลอดทดสอบ 80x1.5 มล. ตู้เย็นที่มีอุณหภูมิตั้งแต่ -20 ^{ไปยัง} C to + 10 ^ของ C;
• ห้องอิเล็คโตรโฟเรสซิส: กล้องสำหรับการอิเล็กโทรโฟเรสซิเดียมในแนวนอน แหล่งจ่ายไฟ; transilluminator;
• เครื่องขยายสัญญาณดีเอ็นเอหรือเครื่องวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก (PCR ในเวลาจริง) ด้วยคอมพิวเตอร์และซอฟต์แวร์ สามารถวางไว้ในห้องว่างใดก็ได้ ถ้าใช้เทคโนโลยี PCR แบบเรียลไทม์ ไม่จำเป็นต้องใช้ห้องอิเลคโตรโฟเรชั่น

[83], [84], [85], [86]

การควบคุมคุณภาพภายนอก

เพื่อให้มั่นใจในการได้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถืออย่างเป็นอิสระห้องปฏิบัติการควรมีส่วนร่วมในระบบการประเมินผลภายนอกของคุณภาพของการวิจัยในห้องปฏิบัติการ

ผู้เข้าร่วมในระบบการควบคุมคุณภาพได้รับ 12 หลอดแห้งแขวนลอยเซลล์ของแบคทีเรียสองซึ่งมีเชื้อ E. Coli อีมะพร้าว 3 ขวดที่มีเชื้อวัณโรค (สายพันธุ์ avirulent) 10 ² / ml; 3 ampoules กับเซลล์ที่มีสายพันธุ์เดียวกันที่ความเข้มข้น 10 ⁴ / ml; 2 ampoules กับ mycobacteria ที่ไม่เป็นวัณโรค M. Avium-intracellulare และ M. Kansasii ที่ความเข้มข้น 10 ⁵ / ml

การทดสอบแบบกระจายสำหรับการประเมินคุณภาพภายนอกได้รับการทดสอบล่วงหน้าในห้องปฏิบัติการอิสระสองแห่งที่มีประสบการณ์ในสาขานี้

[87], [88]